病毒樣顆粒及其原核表達(dá)制備的研究進(jìn)展

于天飛 張喜文 謝鵬宇 黎 明 樊興冬 閆 冰

(1齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院 161006； 2齊齊哈爾大學(xué)計算機(jī)與控制工程學(xué)院 161006；3黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所 齊齊哈爾 161006)

病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)是由病毒的結(jié)構(gòu)蛋白在體外或體內(nèi)自組裝而形成的空心顆粒，不含有病毒的遺傳物質(zhì)[1]。VLPs被認(rèn)為是非常有效的疫苗載體，很多抗原可以通過基因工程或化學(xué)耦連的方法在VLPs表面展示[2]。與傳統(tǒng)疫苗相比，VLPs具有良好的免疫原性和極高的安全性，是一種理想的疫苗形式[3]。此外，VLPs還可作為載體蛋白攜帶外源抗原，是疫苗設(shè)計的重要平臺[4]。目前，已發(fā)現(xiàn)近40種病毒的蛋白能形成VLPs。其中，已上市的3種乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、2種人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)和1種戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)等人類病毒基因工程疫苗均采用VLPs疫苗形式[5]。其他一些針對人或動物疾病的VLPs疫苗也已經(jīng)處于臨床實(shí)驗(yàn)階段[6]。VLPs在科學(xué)研究以及商業(yè)開發(fā)，特別是基因治療等方面具有極大的應(yīng)用優(yōu)勢。

1 VLPs的結(jié)構(gòu)

VLPs由1種或幾種結(jié)構(gòu)(衣殼)蛋白構(gòu)成，通過自我組裝形成。不同病毒的VLPs的結(jié)構(gòu)不盡相同：有的由1種或2種結(jié)構(gòu)蛋白組成，稱為簡單VLPs(如細(xì)小病毒、乳頭瘤病毒、圓環(huán)病毒、戊型肝炎病毒和多瘤病毒等)；有的是由數(shù)個獨(dú)立mRNAs編碼的結(jié)構(gòu)單位構(gòu)成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)(如微小RNA病毒等)；還有的具有來自宿主細(xì)胞的磷脂雙分子層的脂質(zhì)囊膜，其上還可能鑲嵌有糖蛋白形成的纖突蛋白(如流感病毒、艾滋病病毒和丙型肝炎病毒等)[7～9]。

2 VLPs誘導(dǎo)免疫應(yīng)答

VLPs易于被免疫系統(tǒng)識別，能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方式包括：通過表達(dá)在其表面的多價結(jié)構(gòu)結(jié)合Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)和模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)激發(fā)固有免疫應(yīng)答反應(yīng)；誘導(dǎo)強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答并產(chǎn)生高水平的IgM；通過主要組織相容性復(fù)合體I(MHC I)和主要組織相容性復(fù)合體II(MHC II)的交叉呈遞途徑增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞的攝取、加工和呈遞抗原的能力。同時，VLPs的體積較小(平均直徑約40 nm)，使其容易通過淋巴管進(jìn)入淋巴結(jié)中。在淋巴結(jié)，VLPs可以被定居于淋巴結(jié)中的樹突狀細(xì)胞攝取，而VLPs本身較小的尺度和高度有序的表位結(jié)構(gòu)易于樹突狀細(xì)胞的吞噬和抗原加工處理，從而有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對病毒的免疫保護(hù)反應(yīng)[10～12]。

3 VLPs的制備方法

通常利用重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白后進(jìn)行體外或體內(nèi)組裝的方法來制備VLPs。制備VLPs的蛋白表達(dá)系統(tǒng)可分為真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)。據(jù)統(tǒng)計，在已報道的VLPs中，利用真核表達(dá)系統(tǒng)制備的為72%(桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)28%，酵母表達(dá)系統(tǒng)20%，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)15%，植物表達(dá)系統(tǒng)9%)，利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備的為28%[13]。

真核表達(dá)系統(tǒng)具有蛋白輔助折疊與后期修飾等功能，大部分病毒的衣殼蛋白在真核系統(tǒng)都能自組裝形成VLPs。但是由于真核表達(dá)系統(tǒng)常面臨培養(yǎng)周期長、成本高、表達(dá)量低和難純化等難題，制約了VLPs疫苗的研發(fā)和應(yīng)用。制備VLPs的原核表達(dá)系統(tǒng)主要為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。與真核表達(dá)系統(tǒng)相比，原核表達(dá)系統(tǒng)更早、更廣泛地被應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，并且是公認(rèn)的高效、低成本、安全性良好的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。原核表達(dá)系統(tǒng)一般用來制備無囊膜的VLPs[14]。

4 VLPs的原核表達(dá)制備

大腸桿菌來源的VLPs產(chǎn)量高、成本低，尤其適合開發(fā)面向全世界，特別是面向大多數(shù)發(fā)展中國家的新型疫苗。但是由于顆粒性抗原結(jié)構(gòu)和組裝都較為復(fù)雜，因此在大腸桿菌中的VLPs組裝效率較低。同時，原核表達(dá)系統(tǒng)缺少像真核表達(dá)系統(tǒng)那樣的重組蛋白表達(dá)后的修飾能力，不能產(chǎn)生正確的二硫鍵，表達(dá)的重組蛋白的可溶性較差，在表達(dá)重組蛋白的過程中會產(chǎn)生脂多糖或內(nèi)毒素成分。因此，如何利用大腸桿菌進(jìn)行顆粒性抗原的表達(dá)和組裝是當(dāng)今疫苗界的難題之一[14]。近幾年來，在利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備VLPs的技術(shù)取得了一系列突破。

病毒衣殼蛋白可以通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)成包涵體，包涵體在變性條件下純化，然后復(fù)性再折疊，再進(jìn)過自我組裝等過程而有效制備，例如人細(xì)小病毒(human parvovirus)B19和植物病毒豇豆褪綠斑點(diǎn)病(CCMV)及黃瓜花葉病毒(CMV)的VLPs的制備。另外，也可以同時表達(dá)多個結(jié)構(gòu)蛋白，進(jìn)行多層顆粒共組裝，例如傳染性法氏囊病毒的VLPs的制備，該病毒的VLPs由VP2、VP3和VP4三種多聚蛋白構(gòu)成，可以加以表達(dá)和組裝[15]。

簡單的培養(yǎng)條件的改變，如通過低溫培養(yǎng)增強(qiáng)重組蛋白可溶性，即可解決正確構(gòu)象VLPs的自組裝等難題，如濃核病毒IHHNV和馬鈴薯Y病毒(PVY)的制備[16]。另有一些因素，包括表達(dá)質(zhì)粒上的標(biāo)簽蛋白和培養(yǎng)基中的一些成分，也可以影響VLPs的組裝?？赏ㄟ^應(yīng)用不同的融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)來增加重組蛋白的表達(dá)水平和可溶性，如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白[17]。

也有其他的原核表達(dá)宿主被用來制備VLPs，如lactobacillus乳酸菌。有報道稱在在干酪乳桿菌(乳糖誘導(dǎo)表達(dá)菌株)體內(nèi)可通過自我折疊形成人乳頭狀瘤病毒L1株的VLPs。此外，由干酪乳桿菌制備的L1 VLPs 可以用來作為新型的黏膜免疫活疫苗[18]。熒光假單胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡單、可高效表達(dá)可溶性蛋白及培養(yǎng)基譜廣泛等優(yōu)點(diǎn)，可以作為大腸桿菌的替代表達(dá)系統(tǒng)來制備VLPs。植物病毒雀麥花葉病毒(BMV)和CCMV的衣殼蛋白已經(jīng)通過熒光假單胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)在菌體內(nèi)可溶性表達(dá)，所獲VLPs與天然病毒顆粒相似[19]。

5 展望

VLPs作為傳染病和非傳染病疫苗的候選具有極大的優(yōu)勢。VLPs在沒有傳統(tǒng)免疫佐劑的存在下自身即可激發(fā)有效的免疫應(yīng)答。VLPs具有和宿主細(xì)胞天然的親和能力，具有細(xì)胞靶向作用的潛能?；赩LPs的這些優(yōu)勢，有必要對VLPs進(jìn)行深入的研究。迄今，雖然已經(jīng)有數(shù)十種的VLPs在實(shí)驗(yàn)室中成功制備，但只有極少數(shù)能夠在疫苗應(yīng)用中取得突破，獲得合適的放大制備工藝、組裝工藝和制劑工藝組合是阻礙其發(fā)展的重要原因。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在基因工程藥物中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，但在利用其制備和組裝大尺度的、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的VLPs方面仍然存在諸多問題。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)優(yōu)化和分子設(shè)計入手，同時進(jìn)行與大腸桿菌的外源表達(dá)調(diào)控機(jī)制相關(guān)的功能基因改造，使其更適合VLPs的表達(dá)和組裝，可能是解決問題的途徑。