腫瘤蛋白標(biāo)志物分析技術(shù)研究進(jìn)展

鄒　攀, 楊　鑫, 王　靜*, 張艷欣, 張　敏, 杜鵬飛

(1．哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，哈爾濱 150090 ；

2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所)，北京 100081)

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腫瘤蛋白標(biāo)志物分析技術(shù)研究進(jìn)展

鄒攀1,2, 楊鑫1,2, 王靜1,2*, 張艷欣1,2, 張敏1,2, 杜鵬飛2

(1．哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，哈爾濱 150090 ；

2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所)，北京 100081)

摘要：目前，我國(guó)的腫瘤發(fā)病率為285.91/10萬(wàn)，平均每分鐘有6人被診斷為惡性腫瘤，因此腫瘤的早期診斷的重要性顯而易見(jiàn)。隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)診斷技術(shù)的飛速發(fā)展，尋找腫瘤診斷和預(yù)后的特異性標(biāo)志物已成為近期研究的熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)中多項(xiàng)功能的執(zhí)行者，可以直接反映基因給予的信息。相比于基因，蛋白質(zhì)的表達(dá)譜更可以直接地反映功能機(jī)制。針對(duì)蛋白質(zhì)的生物特性，本文總結(jié)了目前臨床中篩查腫瘤蛋白標(biāo)志物分析技術(shù)，如雙向凝膠電泳、基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜、表面增強(qiáng)激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，并對(duì)未來(lái)腫瘤蛋白標(biāo)志物篩查提出新的展望。

關(guān)鍵詞：腫瘤；蛋白標(biāo)志物；分析技術(shù)；研究進(jìn)展

1引言

診斷惡性腫瘤的三大重要方法是腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)、影像學(xué)檢查及組織病理。腫瘤標(biāo)志物可應(yīng)用在對(duì)惡性腫瘤的診斷和隨訪，而且在鑒別診斷、療效評(píng)價(jià)、預(yù)后及檢測(cè)復(fù)發(fā)等領(lǐng)域也具有極其重要的作用[1]。腫瘤標(biāo)志物(Tumor Marker，TM)是特征性存在于惡性腫瘤細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞異常產(chǎn)生的物質(zhì)，正常細(xì)胞沒(méi)有或含量很低的特異性物質(zhì)，或者宿主受腫瘤組織的刺激而產(chǎn)生的物質(zhì)，與正常時(shí)或良性疾病相比，在質(zhì)和量上存在顯著的差異[2]。

腫瘤標(biāo)志物在聯(lián)合臨床和/或其他實(shí)驗(yàn)室檢查中發(fā)揮著不可替代的預(yù)后價(jià)值，且其含量的波動(dòng)有助于治療前病理學(xué)分型[3]。手術(shù)后，腫瘤及正常組織受到破壞，腫瘤標(biāo)志物的含量會(huì)短期上升，其半衰期及殘留腫瘤細(xì)胞對(duì)其下降速度有重要影響。當(dāng)對(duì)化療或放療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，腫瘤標(biāo)志物含量發(fā)生大幅下降與有效的治療有關(guān)，而輕微下降或含量上升則通常提示疾病發(fā)展。由此可見(jiàn)，準(zhǔn)確分析、確定腫瘤標(biāo)記物，對(duì)腫瘤的篩查、診斷、預(yù)后及檢測(cè)療效等方面具有非同尋常的作用[4]。

當(dāng)一個(gè)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞時(shí)，蛋白質(zhì)的表達(dá)會(huì)發(fā)生一些明顯變化，蛋白質(zhì)組分析技術(shù)能夠從細(xì)胞水平上顯示出腫瘤變化過(guò)程中蛋白質(zhì)的改變。本文總結(jié)了近年來(lái)用于腫瘤蛋白標(biāo)志物研究的分析技術(shù)，以期為腫瘤蛋白標(biāo)志物的分析研究提供一定的基礎(chǔ)。

2雙向凝膠電泳技術(shù)

雙向凝膠電泳(2-DE)是目前蛋白組學(xué)的三大支撐技術(shù)之一，另外兩個(gè)技術(shù)分別為蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)[5]。首先根據(jù)等電點(diǎn)不同，蛋白質(zhì)在第一向等電聚焦電泳中得到分離，隨后轉(zhuǎn)移到第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，再根據(jù)分子量大小進(jìn)行分離。固相pH梯度等電聚焦技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，雙向電泳的分辨率和重復(fù)率得到了大幅度提高。

雙向凝膠電泳技術(shù)上存在固有不足，如不能分辨低豐度的蛋白，不能分辨極酸和極堿性的蛋白，不能分辨分子量過(guò)高和過(guò)低的蛋白等[6]。但是雙向凝膠電泳具有良好的直觀性、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高和方法成熟穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，目前仍然是蛋白組學(xué)研究的重要手段[7]。

鄭小華等人通過(guò)優(yōu)化雙向電泳條件，確定了適合肝癌細(xì)胞HepG2的最佳雙向電泳條件，獲得了高分辨率、重復(fù)性好的2-DE圖譜，分離得到335個(gè)清晰的蛋白點(diǎn)，為進(jìn)一步開(kāi)展蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供有利前提[8]。

在雙向凝膠電泳的基礎(chǔ)上，發(fā)展出一種新型的分析手段，即熒光差異顯示雙向凝膠電泳(F-2D-DIGE)。等電聚焦前，首先用不同的熒光標(biāo)記試劑標(biāo)記等量樣品，混合樣品后進(jìn)行雙向電泳，采用不同的波長(zhǎng)對(duì)所得到的凝膠激發(fā)，可得到不同樣品結(jié)果，分析得到存在表達(dá)差異的蛋白質(zhì)。本方法可以在同一塊凝膠上分析多種樣品，減輕工作量，降低實(shí)驗(yàn)誤差，同時(shí)具有較寬的線性動(dòng)態(tài)定量范圍。此外，如在凝膠中加入內(nèi)標(biāo)，可使不同凝膠中蛋白質(zhì)豐度的比較更加準(zhǔn)確[9,10]。

3基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜

基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)特別適合于蛋白等生物大分子的高通量篩選，還可以對(duì)寡核苷酸、基因的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行分析；對(duì)天然與合成高分子的分子量和分子量分布進(jìn)行分析。MALDI利用氮源脈沖激光使樣品從固相表面解吸，與此同時(shí)產(chǎn)生一系列不同質(zhì)荷比的單價(jià)氣態(tài)離子，然后用TOF計(jì)量法測(cè)得離子通過(guò)相應(yīng)檢測(cè)器所用時(shí)間從而獲得肽段的質(zhì)量。

張瑋等人用MALDI-TOF結(jié)合激光捕獲顯微切割(LCM)技術(shù)確定卵巢癌外周血中趨化因子配體18蛋白(CCL18)升高的細(xì)胞來(lái)源。正常卵巢組織上皮細(xì)胞中未檢出CCL18表達(dá)，但是卵巢癌組織上皮細(xì)胞中CCL18蛋白表達(dá)量高，因此CCL18有可能成為新一代卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物[11]。通過(guò)聯(lián)合使用2-DE和MALDI-TOF-MS技術(shù)，孫明飛等[12]、宋大萍等[13,14]和Giribaldi[15]等，分別建立肺腺癌、宮頸癌和腎細(xì)胞癌的差異蛋白圖譜，確定了與腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)，為肺腺癌和宮頸癌腫瘤標(biāo)志物研究奠定基礎(chǔ)。

MALDI-TOF多肽質(zhì)譜指紋識(shí)別技術(shù)(PMF)是用于蛋白定量的一種最快速、成本低廉的方法。MALDI-TOF-MS和蛋白組學(xué)儀器的迅速發(fā)展使腫瘤標(biāo)志物的快速識(shí)別成為可能，并能通過(guò)體液測(cè)定對(duì)腫瘤診斷和預(yù)后提供可靠信息[16,17]。越來(lái)越多的研究表明MALDI-TOF-MS技術(shù)不僅可用于定性分析，還有助于臨床分析中蛋白標(biāo)記物的定量分析[18]。

MALDI-TOF有眾多優(yōu)點(diǎn)，如分析速度快、樣品用量少、高靈敏度、操作簡(jiǎn)便、試劑價(jià)格較低及質(zhì)荷比檢測(cè)范圍廣等。但是有研究報(bào)道MALDI-TOF系統(tǒng)平行性和定量計(jì)算等方面的缺點(diǎn)。這是由于MALDI-TOF過(guò)度依賴(lài)于儀器的設(shè)置參數(shù)，如去除干擾離子的偏轉(zhuǎn)質(zhì)量、用于峰定量的校準(zhǔn)類(lèi)型等[19]。MS數(shù)據(jù)含有大量噪音信號(hào)，這些噪音信號(hào)大多由儀器設(shè)置、電信號(hào)傳遞過(guò)程中產(chǎn)生的噪音等引起的。因此，在數(shù)據(jù)預(yù)處理過(guò)程中，需要減少噪音信號(hào)及系統(tǒng)偏差，包括校正基線、去噪音處理、信號(hào)峰校準(zhǔn)等。此外，仍需更穩(wěn)固的計(jì)算方法以降低未知的內(nèi)在生物差異引起的變異影響[20,21]。

4表面增強(qiáng)激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜

目前，表面增強(qiáng)激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-TOF-MS)廣泛用于分析體液的蛋白多肽譜，篩選潛在疾病相關(guān)蛋白質(zhì)分子[22]。

蛋白質(zhì)芯片陣列和質(zhì)譜儀組成了SELDI-TOF-MS系統(tǒng)，根據(jù)蛋白質(zhì)芯片的物質(zhì)特性，可分為化學(xué)芯片和生物芯片兩類(lèi)。通過(guò)疏水力、靜電力、共價(jià)鍵等結(jié)合樣本中的蛋白質(zhì)的芯片為化學(xué)芯片；生物芯片則利用受體與配體、抗原與抗體、酶與底物等的相互作用捕獲樣本中的蛋白質(zhì)[23]。由于SELDI-TOF-MS技術(shù)不依賴(lài)于蛋白質(zhì)的構(gòu)象，從而優(yōu)于普通蛋白質(zhì)芯片，因?yàn)樗鼈冃枰O(shè)計(jì)與重組蛋白質(zhì)結(jié)合的技術(shù)[24,25]。

該法利用激光脈沖輻射使分析物解吸形成荷電離子，然后根據(jù)不同質(zhì)荷比的離子的飛行時(shí)間不同，從而得到質(zhì)譜圖。通過(guò)軟件分析處理后，直接顯示樣品中蛋白質(zhì)的種類(lèi)及其分子量和含量等信息。若將軟件分析模擬譜圖與健康人群、某種疾病病人的譜圖比對(duì)分析，就能發(fā)掘該疾病相關(guān)的蛋白[26]。幾分鐘內(nèi)就可完成整個(gè)測(cè)定分析過(guò)程，迅速且方法敏感，結(jié)果特異性高，并且不會(huì)破壞所測(cè)定的蛋白質(zhì)。

SELDI-TOF-MS可不需處理血清、尿液、組織抽取物等直接進(jìn)行點(diǎn)樣檢測(cè)[27]，使樣本與可溶的基質(zhì)共結(jié)晶來(lái)產(chǎn)生質(zhì)譜信號(hào)。在200 Da～500 kDa區(qū)間的樣品經(jīng)SELDI-TOF-MS分析可得到清晰的質(zhì)譜，每個(gè)樣本的分析時(shí)間僅為幾十分鐘，但是得到的信息量遠(yuǎn)大于雙向凝膠電泳；只要與表面探針結(jié)合，就可以檢測(cè)到低豐度蛋白質(zhì)，這也是雙向電泳不具備的特性[28]。SELDI-TOF-MS具有下列優(yōu)勢(shì)：(1)對(duì)粗樣本直接分析處理，如血清、尿液等；(2)不僅可發(fā)現(xiàn)一種蛋白質(zhì)或生物標(biāo)記分子，而且還可以發(fā)現(xiàn)多種組合方式的蛋白質(zhì)圖譜；(3)推動(dòng)基因組學(xué)發(fā)展，基于蛋白質(zhì)特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)新的基因；(4)使大規(guī)模、超微量、高通量、全自動(dòng)篩選蛋白質(zhì)成為可能[29]。

徐文鴻等人采用SELDI-TOF-MS技術(shù)和CM10蛋白芯片，檢測(cè)76例大腸癌患者術(shù)前血清蛋白質(zhì)指紋圖譜，篩選出的腫瘤標(biāo)志物可以指導(dǎo)大腸癌的綜合治療，所建立的診斷模型可以輔助臨床明確大腸的術(shù)前分期[30]。相對(duì)于SELDI-TOF-MS在其他腫瘤中的成功應(yīng)用，其在肺癌研究中沒(méi)有發(fā)揮該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)。目前研究很少考慮組織學(xué)類(lèi)型對(duì)血清蛋白的影響，未能按國(guó)際肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等原因，因此，SELDI-TOF-MS在肺癌研究中仍有待改進(jìn)，以推動(dòng)肺癌腫瘤標(biāo)志物的研究[31]。

SELDI-TOF-MS的差異峰鑒定比較困難，主要是因?yàn)楹茈y洗脫下結(jié)合在芯片上的蛋白質(zhì)，并且結(jié)合的蛋白質(zhì)含量很少，用現(xiàn)有的方法難以進(jìn)行分析鑒定，只能得到差異多肽的分子量等信息[32]。此外，該技術(shù)不能進(jìn)行后續(xù)鑒定，不能得出N-端、C-端序列和蛋白質(zhì)的構(gòu)型，仍需要與雙向電泳、生物信息學(xué)等技術(shù)聯(lián)合使用[33]。

5蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

蛋白質(zhì)芯片(Protein Chip)技術(shù)是一種高通量、高靈敏度、高特異性的分析技術(shù)。它不僅是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中強(qiáng)有力的工具，也是臨床中疾病早期診斷、預(yù)后和治療效果評(píng)測(cè)新手段。

蛋白質(zhì)芯片用未經(jīng)標(biāo)記或標(biāo)記的生物分子與芯片上的探針進(jìn)行反應(yīng)，再通過(guò)特定的掃描裝置進(jìn)行檢測(cè)、分析處理，是一種將多種蛋白質(zhì)有序地固定于介質(zhì)載體上的蛋白微陣列。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的優(yōu)勢(shì)有：(1)特異性強(qiáng)。相對(duì)于傳統(tǒng)的ELISA分析，蛋白質(zhì)芯片采用光敏染料標(biāo)記，靈敏度高； (2)樣品的前處理簡(jiǎn)單，只需對(duì)少量標(biāo)本進(jìn)行沉降分離和標(biāo)記后，即可進(jìn)行分析和檢測(cè)；(3)效率極高。一次實(shí)驗(yàn)可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種目標(biāo)蛋白進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)；(4)使用簡(jiǎn)單，全自動(dòng)化操作，結(jié)果正確率高；(5)重復(fù)性好，不同次實(shí)驗(yàn)間相同兩點(diǎn)之間差異??； (6)適用于細(xì)胞系、組織和體液等多種生物樣品[34]。

于新宇采用12種腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片對(duì)12 574名健康體檢者及6 404名初次住院患者的血清進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)C12多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果陽(yáng)性者與臨床診斷符合率高達(dá)72.76%，為健康體檢、臨床腫瘤輔助診斷和高危人群早期腫瘤篩查提供新的方法[35]。王文濤采用納米金探針和蛋白芯片技術(shù)，建立了高靈敏度多腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)體系，確定的四種腫瘤標(biāo)志物在蛋白芯片上無(wú)交叉反應(yīng)和相互干擾，特異性良好，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)多種腫瘤標(biāo)志物同時(shí)快速檢測(cè)，達(dá)到對(duì)肺癌早期診斷的目的[36]。伊力亞爾·努爾如拉等人選取40例腎透明細(xì)胞癌患者和53例同期健康志愿者及非腎癌患者，運(yùn)用CM10弱陽(yáng)離子交換蛋白芯片技術(shù)與SELDI-TOF-MS聯(lián)合檢測(cè)腎癌組及對(duì)照組血清差異蛋白，得到5種蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)腎透明細(xì)胞癌的靈敏度為87.5%，為腎透明細(xì)胞癌的療效評(píng)價(jià)、預(yù)后評(píng)估及靶向治療有一定的參考價(jià)值[37]。

蛋白質(zhì)芯片的制備及反應(yīng)過(guò)程比基因芯片更復(fù)雜。無(wú)論是將蛋白質(zhì)固定于載體上又要保持其生物活性，或是蛋白質(zhì)的合成來(lái)說(shuō)，都存在著技術(shù)難題。該方法主要依賴(lài)于抗體及其他大分子，但是規(guī)模生產(chǎn)存在很多問(wèn)題，需要建立高通量蛋白表達(dá)和純化的方法。此外，需研制新載體及改進(jìn)基質(zhì)材料表面處理方法，以促使蛋白質(zhì)特異性吸附到載體上[38]。隨著蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的日益完善，它必將會(huì)以其各大優(yōu)點(diǎn)在蛋白質(zhì)組學(xué)和其他領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越大的作用，為腫瘤疾病的診斷提供更有利的技術(shù)支持。

6展望

上述方法都以其優(yōu)勢(shì)在分析腫瘤蛋白標(biāo)志物中發(fā)揮著重要作用，但其缺點(diǎn)影響了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)尚未發(fā)展出與基因分析中PCR擴(kuò)增技術(shù)類(lèi)似的技術(shù)使得低豐度蛋白質(zhì)擴(kuò)增，而由于高豐度蛋白質(zhì)分子的掩蓋，低豐度蛋白質(zhì)通常很難分離。另外，對(duì)極酸性、極堿性和難溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和鑒定很難，因此會(huì)丟失許多重要蛋白質(zhì)的信息[39]。因此，在未來(lái)腫瘤標(biāo)志物分析中，需要將各種分析手段聯(lián)合起來(lái)，取長(zhǎng)補(bǔ)短，多種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)聯(lián)合篩查腫瘤相關(guān)蛋白，這對(duì)探明腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)理，提高臨床早期發(fā)現(xiàn)腫瘤具有重要意義。此外，還需進(jìn)一步豐富和發(fā)展蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，提高敏感性、穩(wěn)定性、可重復(fù)性和特異性，以期獲取更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，發(fā)揮腫瘤標(biāo)志物在腫瘤早期篩查、診斷、預(yù)后及治療效果的評(píng)價(jià)中的重要價(jià)值。

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Advance in analysis techniques of screening tumor protein marker

ZOU Pan1,2, YANG Xin1,2, WANG Jing1,2*, ZHANG Yanxin1,2, ZHANG Min1,2, DU Pengfei2

(1.SchoolofChemicalEngineering&Technology,HarbinInstituteofTechnology,Harbin150090,China;2.KeyLaboratoryofAgro-productQualityandSafety,InstituteofQualityStandard&TestingTechnologyforAgro-Product(MinistryofAgriculture,ChineseAcademyofAgriculturalSciences),Beijing100081,China)

Abstract：Nowadays, tumor incidence is high up to 285.91 in one hundred thousand, and six patients are diagnosed with malignant tumor every minute.Therefore, the early tumor diagnosis becomes more and more important. With the development of molecular biology and immune diagnosis technology, researchers pay more attention to specific marker screening for tumor diagnosis and prognosis. As the executant of many biological functions in vital movements, protein can reflect hereditary information directly, and protein expression profile is much clearer than gene expression profiling in reporting biological function mechanisms. According to the biological traits of protein, we summarized several techniques of tumor protein marker in clinical screening, including 2-D gel electrophoresis, matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight-mass-spectrometry, surface enhanced laser desorption/ionization-time-of-flight-mass-spectrometry and protein chip. At last, we put forward expectations of tumor protein marker screening.

Keywords：Tumor; Protein marker; Analysis technology；Progress

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ937

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-5565(2016)01-026-05

doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.01.05

作者簡(jiǎn)介：鄒攀，女，博士研究生；研究方向：天然活性產(chǎn)物；E-mail：zoupan0601@163.com.*通信作者：王靜，女，教授，博士生導(dǎo)師；研究方向：天然活性產(chǎn)物；E-mail: w_jing2001@126.com.

基金項(xiàng)目：科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化基金項(xiàng)目支持(資助號(hào)：No.2008GB23260349)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目支持(資助號(hào)：No.31000831)。

收稿日期：2015-10-15;修回日期：2015-12-07.