載阿霉素聚合物納米粒的制備、表征與體內外性能研究

胡春艷 陳卓 務圣潔 樊帆 秦玉 王海 朱敦皖 張琳華

300192天津，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院生物醫(yī)學工程研究所，天津市生物醫(yī)學材料重點實驗室

載阿霉素聚合物納米粒的制備、表征與體內外性能研究

胡春艷 陳卓 務圣潔 樊帆 秦玉 王海 朱敦皖 張琳華

300192天津，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院生物醫(yī)學工程研究所，天津市生物醫(yī)學材料重點實驗室

目的 以兩親性三嵌段共聚物聚己內酯-聚乙二醇-聚己內酯（PCL-b-PEG-b-PCL）為載體材料，制備包載抗腫瘤藥物阿霉素（DOX）的聚合物納米粒，并對其進行體內外性能研究。方法 以PCL-b-PEG-b-PCL作為載體材料，通過薄膜水化超聲分散法制備出載DOX的聚合物納米粒，并對其形態(tài)、粒徑及其分布、載藥量及包封率等理化性能進行表征。采用MTS法研究載DOX聚合物納米粒對EMT6乳腺癌細胞的細胞毒性，激光掃描共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察EMT6細胞對納米粒的細胞吞噬，離體臟器熒光成像研究納米粒在荷EMT6乳腺癌小鼠的組織分布。結果 通過薄膜水化超聲分散法成功制備出載DOX聚合物納米粒，透射電鏡和掃描電鏡結果表明，該納米粒呈球形，大小均勻，具有明顯的核殼結構。粒度分析表明，載DOX聚合物納米粒的平均粒徑為130.8 nm，且粒徑分布較窄（多分散系數(shù)為0.200）。DOX在聚合物納米粒中的包封率和載藥量分別為（86.71±2.05）%和（8.71±0.57）%。細胞毒性研究發(fā)現(xiàn)，空白納米粒對EMT6細胞無毒性，而載入DOX后，DOX-NPs的細胞毒性具有時間和劑量依賴性；在DOX質量濃度較高（20 μg/ml和40 μg/ml）和孵育時間較長（72 h）時，載DOX聚合物納米粒與游離DOX的細胞毒性相當，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。CLSM觀察發(fā)現(xiàn)，EMT6乳腺癌細胞與載DOX聚合物納米粒共同孵育后，DOX的熒光在細胞質和細胞核中均有分布，但與游離DOX共同孵育后，DOX的紅色熒光主要出現(xiàn)在細胞核中。離體臟器熒光成像研究表明，分別對荷EMT6乳腺癌小鼠尾靜脈注射載DOX聚合物納米粒及游離DOX后，載DOX聚合物納米?？赏ㄟ^增強滲透和滯留效應（EPR）在腫瘤部位有效聚集。結論 載DOX聚合物納米粒具有適合靜脈注射的粒徑、高載藥量和包封率及良好的被動靶向特性，是一種在腫瘤治療中具有潛在應用前景的納米藥物遞送系統(tǒng)。

聚合物納米粒； 被動靶向； 藥物遞送； 乳腺癌； 阿霉素

Fund program:National Natural Science Foundation of China(81571793,51373199,81671806);Tianjin Natural Science Foundation(15JCZDJC38300);Basic Scientific Research Funds Programs in National Nonprofit Scientific Research Institutes(2016ZX310095,2016ZX310098)

0 引 言

阿霉素（doxorubicin,DOX）是一種蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，對乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌和前列腺癌及急性淋巴細胞白血病具有良好的治療效果[1-2]。然而，半衰期短和心臟毒性等缺點限制了其臨床應用。為了提高DOX的臨床治療效果并降低其嚴重的毒副作用，新型DOX藥物遞送系統(tǒng)如脂質體[3-4]、聚合物納米粒[5-7]等受到了廣泛關注。

近十年來，由兩親性嵌段共聚物自組裝形成的聚合物納米粒在藥物遞送載體方面引起了研究人員的廣泛興趣[8-9]。聚合物納米粒具有核殼結構，在選擇性溶劑中，溶解性差的鏈段形成膠束的內核，溶解性好的鏈段形成膠束的外殼。作為一種高效的藥物載體，聚合物膠束的疏水性內核可包載疏水性藥物，降低其對人體的毒副作用；親水性外殼可提高藥物的穩(wěn)定性，并影響膠束的體內外行為，并可通過增強滲透和滯留效應（enhanced permeability and retention effect，EPR）在腫瘤部位不斷蓄積[10-11]。

聚合物納米粒通常由兩親性嵌段共聚物聚己二醇（polyethylene glycol,PEG）-R組成，R代表疏水性的可生物降解組分如聚乳酸羥基乙酸共聚物（PLGA）、聚乳酸（PLA）、聚己內酯（polycaprolactone, PCL）及其共聚物[12]。在水溶液中形成聚合物納米粒的兩親性共聚物類型有A-B兩嵌段共聚物及A-BA和B-A-B三嵌段共聚物，其中A和B分別代表親水嵌段和疏水嵌段。由A-B兩嵌段和A-B-A三嵌段形成的納米粒表面是“刷狀”親水性外殼結構，而BA-B三嵌段共聚物形成的納米粒表面是“花狀”親水性外殼結構[13]。與具有“刷狀”親水性外殼的納米粒相比，“花狀”親水性外殼的納米粒中親水嵌段的末端錨定在核殼交界處，封閉的表面親水結構使其具有更好的穩(wěn)定性和更高的藥物包封率，可更有效地阻止體內調理素的結合，從而具有更好的長循環(huán)特性[14-15]。

PEG和PCL均為已被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準使用的具有良好生物相容性和可生物降解的材料，在生物醫(yī)藥和藥物遞送領域具有廣泛的應用前景。兩親性PCL/PEG可通過改變分子質量和疏水嵌段與親水嵌段比例來形成微粒/納米?；驕孛羲z。PCL-PEG-PCL共聚物可制備出具有“花狀”表面結構的納米粒，包載藥物后所形成的載藥納米粒具有良好的穩(wěn)定性和長循環(huán)特性，是一種良好的可注射用藥物遞送載體[16-18]。本研究擬制備基于PCL-PEG-PCL共聚物的“花狀”載DOX聚合物納米粒，使其適合靜脈注射，并可利用EPR將抗腫瘤藥物被動靶向遞送至腫瘤部位。采用薄膜水化超聲分散法制備載DOX納米粒并對其進行形貌、粒徑及其分布、載藥量和包封率等理化性能表征，研究其對EMT6乳腺癌細胞的細胞毒性和細胞吞噬性能，并通過對荷EMT6乳腺癌小鼠的主要器官和腫瘤進行體外成像考察DOX的熒光強弱及組織分布，以評價該藥物遞送系統(tǒng)的被動靶向效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

ε-己內酯（ε-CL）、PEG（分子質量為8 000 u）（美國Sigma-Aldrich公司），鹽酸阿霉素（DOX·HCl）（大連美侖生物科技公司），CellTiter 96?Aqueous單溶液細胞增殖檢測試劑盒（MTS）（美國Promega公司），微絲綠色熒光蛋白（Actin-trackerGreen）、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole）（DAPI）溶液（上海碧云天生物技術有限公司），所有的細胞培養(yǎng)基和其他組分（美國Gibco公司）。BALB/c雌性裸鼠，體質量為18～22 g，購自天津醫(yī)科大學動物實驗中心。

SpectraMax Plus384酶標儀（美國 Molecular Devices公司），Sigma 2-16K離心機（德國Sigma公司），LSM710激光掃描共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy,CLSM）（德國Carl Zeiss公司），VCX-130PB小探頭超聲器（美國Sonics&Materials公司），Sirion 200掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope,SEM）、Tecnai-F20透射電子顯微鏡（transmission electron microscope,TEM）（荷蘭 FEI公司），Nano-ZS90粒度分析儀（英國Malvern儀器有限公司），CRIMaestro體內成像系統(tǒng)（美國CRI公司）。

1.2 方法

1.2.1 載DOX聚合物納米粒的制備

載DOX聚合物納米粒通過之前報道的薄膜水化超聲分散法[19]制得，整個制備過程在避光條件下進行。DOX·HCl用甲醇溶解后與三乙胺混合，室溫下磁力攪拌過夜；PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物用二氯甲烷溶解后加入含有DOX的甲醇溶液，通過旋轉蒸發(fā)去除有機溶劑獲得DOX/共聚物的薄膜層；薄膜層用水浴預熱形成透明的凝膠狀樣品，加入去離子水后水化一定時間；混合物在冰浴下用小探頭超聲器超聲10 min獲得澄清的納米?；鞈乙海蛔詈髮⒃摶鞈乙?3 000 r/min離心30 min，離心3次以去除未包載的DOX。

1.2.2 載DOX聚合物納米粒的表征

納米粒的形態(tài)結構通過SEM和TEM表征。載藥納米粒的粒徑和多分散系數(shù)通過粒度分析儀測定。納米粒中包載的DOX含量采用紫外/可見光吸收光譜法在480 nm下測得，藥物的載藥量和包封率分別通過以下公式計算

1.2.3 體外細胞毒性實驗

通過CellTiter 96?Aqueous單溶液細胞增殖檢測試劑盒（MTS）檢測載DOX聚合物納米粒對EMT6乳腺癌細胞的細胞毒性。用0.25%胰蛋白酶消化單層EMT6乳腺癌細胞，再用含體積分數(shù)為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配成單細胞懸液；以每孔約5000個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100μl，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h；用200 μl含游離DOX或載DOX聚合物納米粒的培養(yǎng)基替換（DOX的質量濃度分別為0.5、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/ml），孵育24、48、72 h；棄掉培養(yǎng)基，每孔加入80 μl新鮮培養(yǎng)基后再加入20 μl MTS試劑，孵育3 h后用酶標儀于490 nm處測定吸光度（OD）值。按下式計算細胞存活率，并繪制細胞生長抑制曲線。

1.2.4 體外細胞吞噬實驗

利用DOX具有自發(fā)熒光，采用CLSM觀察EMT6乳腺癌細胞對游離DOX及載DOX聚合物納米粒的吞噬。將EMT6乳腺癌細胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；細胞貼壁生長后吸棄培養(yǎng)基，加入用培養(yǎng)基稀釋的游離DOX及載DOX聚合物納米粒（DOX的質量濃度均為20 μg/ml），孵育24 h后棄掉培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）洗滌3次；加入免疫染色固定液固定10 min，免疫染色洗滌液洗滌3次；然后用微絲綠色熒光蛋白（Actin-tracker Green）染色1 h；用免疫染色洗滌液洗滌后加入DAPI溶液染細胞核5 min，PBS洗滌3次；最后用CLSM觀察細胞吞噬情況。

1.2.5 荷瘤小鼠體內分布研究

將EMT6細胞（1×106個）皮下注射接種于BALB/c小鼠腋下，等腫瘤大小達到100 mm3即可進行實驗。對荷瘤小鼠分別尾靜脈注射游離DOX和載DOX聚合物納米粒，DOX劑量均為10 mg/kg。于注射后4 h和24 h處死小鼠，收集腫瘤和主要器官（心、肝、脾、肺、腎），用PBS沖洗。臟器用CRI Maestro體內成像系統(tǒng)在激發(fā)波長523 nm和發(fā)射波長560 nm處成像，圖像用CRI Maestro分析軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據，數(shù)據以均值±標準差（±s）表示，樣本間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與討論

2.1 載DOX聚合物納米粒的表征

本研究用三乙胺去除DOX·HCl的鹽酸使其轉化為疏水性，并通過薄膜水化超聲分散法成功制備出疏水性內核載疏水性藥物DOX的聚合物納米粒。如圖1A所示，制備的載DOX聚合物納米粒懸液為紅色均勻分散體系。圖1B為載DOX聚合物納米粒的示意圖，親油性的PCL鏈段包裹或纏繞DOX依靠疏水作用將DOX載入聚合物膠束的疏水性內核中，親水性的PEG鏈段兩端被錨定在核殼交界處，并向水相伸展形成親水性殼層，從而使載藥聚合物納米粒能很好地分散于水相并具有長循環(huán)特性。SEM圖表明載藥納米粒具有粗糙表面的均一球形結構（圖1C）；TEM圖表明所制備的載DOX聚合物納米粒具有明顯的核殼結構（圖1D），親水性PEG鏈段包裹在疏水性內核外圍形成具有明顯冠狀結構表面。由PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物形成的聚合物納米粒，PEG的兩端被錨定在核殼交界處，形成的“花狀”親水性結構可更有效地阻止體內調理素的結合，使納米粒更加穩(wěn)定，具有更好的長循環(huán)特性[14-15]。用粒度分析儀對載DOX聚合物納米粒進行粒徑及其分布測定。如圖1E所示，載藥量為8.72%的載DOX聚合物納米粒的平均粒徑為130.8nm，且有較窄的粒徑分布（多分散系數(shù)為0.200）。載DOX聚合物納米粒的納米尺寸及窄粒徑分布利于其進行腫瘤的被動靶向遞送。

2.2 載DOX聚合物納米粒的體外細胞毒性研究

為了研究釋放的DOX是否仍具有藥理活性，并評價載藥納米粒的細胞毒性，本研究采用MTS法研究載DOX聚合物納米粒、游離DOX及空白聚合物納米粒對EMT6乳腺癌細胞的細胞毒性。細胞培養(yǎng)基中DOX的質量濃度為0.5～40 μg/ml，各組對EMT6乳腺癌細胞的生長抑制曲線如圖2所示?？瞻拙酆衔锛{米粒無明顯的細胞毒性，故可作為藥物載體，而游離DOX和載DOX聚合物納米粒的細胞毒性則具有時間和劑量依賴性。與載DOX聚合物納米粒相比，游離DOX在與EMT6乳腺癌細胞孵育24 h和48 h后對腫瘤細胞具有更高的細胞毒性（P＜0.05）。然而，孵育72 h后顯示在DOX高質量濃度（20 μg/ml和40 μg/ml）時，游離DOX和載DOX聚合物納米粒的細胞毒性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。這可能是由于腫瘤細胞對游離DOX和載DOX聚合物納米粒具有不同的攝取機制。在細胞培養(yǎng)過程中，大多數(shù)游離DOX可通過被動擴散方式快速進入細胞核發(fā)揮作用，而載藥納米粒主要通過胞吞方式進入腫瘤細胞，且待藥物分子從納米粒中釋放出來才發(fā)揮抗腫瘤活性。因此，這就需要足夠時間使載DOX聚合物納米粒顯示其細胞毒性。

2.3 體外細胞攝取

為研究細胞對載DOX聚合物納米粒的攝取及其在細胞內的分布，用CLSM觀察游離DOX和載DOX聚合物納米粒與EMT6乳腺癌細胞共同孵育24 h后的細胞吞噬情況。細胞骨架用微絲熒光蛋白染色，細胞核用DAPI染色。結果如圖3所示，載DOX聚合物納米粒的DOX熒光（紅色）分布于細胞骨架、細胞質和細胞核，而游離DOX的紅色熒光主要分布于細胞核中。同時，由于細胞對游離DOX和載DOX聚合物納米粒的攝取方式不同，游離DOX通過擴散方式能快速穿過細胞膜被轉運進細胞核[20]，而載DOX聚合物納米粒通過腫瘤細胞的胞吞作用入胞，因此與細胞共同孵育后，游離DOX在細胞核內顯示出更強的DOX熒光。DOX是在DNA合成過程中發(fā)揮細胞毒性作用，當DOX包載在納米粒中后通過胞吞作用進入細胞，并最終釋放DOX進入細胞核中發(fā)揮作用。

2.4 荷瘤小鼠體內分布研究

采用CRI Maestro體內成像系統(tǒng)分析尾靜脈給藥后載DOX聚合物納米粒和游離DOX在組織臟器中的分布。對荷EMT6乳腺癌小鼠分別尾靜脈注射載DOX聚合物納米粒和游離DOX（10 mg/kg）后，于4 h和24 h處死小鼠，分離主要器官（心、肝、脾、肺、腎）和腫瘤用于體外DOX熒光成像，陰性對照組尾靜脈注射生理鹽水。如圖4所示，游離DOX組注射后4 h在腎和肝發(fā)現(xiàn)強烈的DOX熒光，且隨著時間延長這些器官的熒光逐漸變弱，表明DOX被腎和肝代謝而快速從體內排出[21]；載DOX聚合物納米粒組注射后4 h在肝臟首先發(fā)現(xiàn)強烈的DOX熒光；與游離DOX組相比，載DOX聚合物納米粒組在注射后24 h腫瘤部位的DOX分布及積蓄明顯增強，這與之前報道的具有小粒徑（70～200 nm）的納米粒會通過EPR在腫瘤部位選擇性積累一致[22-23]。研究表明，載藥聚合物納米粒可明顯提高藥物穩(wěn)定性，延長血液循環(huán)時間，并通過EPR有效地將藥物富集于腫瘤部位。

3 結論

本研究通過薄膜水化超聲分散法成功制備了基于PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物的載DOX聚合物納米粒。獲得的載DOX聚合物納米粒具有明顯的核殼結構、適合靜脈注射的粒徑和高包封率。體外細胞毒性研究表明，具有高質量濃度的載DOX聚物合納米粒與EMT6乳腺癌細胞孵育長時間（72 h）所產生的細胞毒性與游離DOX（相同時間和相同DOX質量濃度）產生的細胞毒性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。體外細胞攝取實驗結果表明，當用載DOX聚物合納米粒與EMT6乳腺癌細胞共同孵育后，DOX熒光在細胞質和細胞核中均有分布，且經長時間孵育后核中熒光強度比細胞質中要高，表明納米粒先攝取入胞再釋放DOX入核。體外成像分布結果表明，載DOX聚物合納米粒對腫瘤組織滲透能力比正常組織強，且與游離DOX相比，載DOX聚物合納米粒在腫瘤組織的DOX積蓄量更多。綜上所述，本研究制備的載DOX聚合物納米粒有望成為一種新型的抗腫瘤藥物納米遞送載體。

利益沖突 無

（圖1～4見插頁4-7、4-8）

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Preparation,characterization,in vitro and in vivo evaluation ofdoxorubicin-loaded polymeric nanoparticles

Hu Chunyan,Chen Zhuo,Wu Shengjie,Fan Fan,Qin Yu,Wang Hai,Zhu Dunwan,Zhang Linhua

Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin Key Laboratory of Biomedical Materials,Tianjin 300192,China

Zhang Linhua,Email:zlhbme@163.com

Objective To prepare and evaluate the polymeric nanoparticles based on PCL-PEG-PCL amphiphilic triblock copolymers for doxorubicin delivery against breast cancer.Methods PCL-PEG-PCL amphiphilic triblock copolymers were used to encapsulate doxorubicin by thin-film hydration and an ultrasonic dispersion method.The prepared DOX-loaded polymeric nanoparticles were characterized in terms of morphology, particle size and size distribution,drug loading content and encapsulation efficiency.In vitro cytotoxicity against EMT6 cell line was assessed by MTS assay.Confocal laser scanning microscopy(CLSM)was used to evaluate the cellular uptake of DOX-loaded polymeric nanoparticles.Ex vivo DOX fluorescence imaging of the isolated major organs and tumors in EMT6 tumor-bearing mice was observed.Results The DOX-loaded polymeric nanoparticles were successfully prepared by thin-film hydration and ultrasonic dispersion method.Transmission electron microscope and scanning electron microscope verified that the DOX-loaded polymeric nanoparticles were homogeneous spherical shapes with apparent core-shell morphology.The average particle size of the DOX-loaded polymeric nanoparticles was 130.8 nm with a narrow size distribution(polydispersity index was 0.200).DOX was entrapped in the polymeric nanoparticles with encapsulation efficiency and loading content of(86.71±2.05)%and(8.72±0.57)%,respectively.In vitro cytotoxicity assay against EMT6 cells demonstrated that the blank nanoparticles exhibited no cytotoxicity,while the cytotoxic effect of DOX-loaded polymeric nanoparticles gradually approached that of free DOX when increasing the concentration and the incubation time.CLSM results showed that the DOX fluorescence was distributed both in the cytoplasm and nucleus for DOX-loaded polymeric nanoparticles treated cells,while the red fluorescence was observed mostly in the nucleus for free DOX treated cells.Furthermore,ex vivo DOX fluorescence imaging revealed that DOX-loaded polymeric nanoparticles had highly efficient targeting and accumulation at the implanted site of an EMT6 xenograft tumor in vivo through enhanced permeability and retention effect(EPR).Conclusions The prepared DOX-loaded polymeric nanoparticles showed satisfactory size and narrow size distribution，high encapsulation efficiency and drug loading content,efficient passive targeting via EPR.These results suggest that the DOX-loaded polymeric nanoparticles might have the potential to be developed as a nano-drug delivery system for cancer chemotherapy.

Polymeric nanoparticles;Passive targeting;Drug delivery;Breast cancer;Doxorubicin

張琳華，Email:zlhbme@163.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．04．003

國家自然科學基金面上項目（81571793，51373199，81671806）；天津市自然科學基金重點項目（15JCZDJC38300）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費（2016ZX310095，2016ZX310098）

2016-05-16）