燒傷病房鮑曼不動桿菌耐藥性及OXA基因型檢測

呂大倫 陳 雷 丁 偉 徐姝娟 張 煒 王合麗 王 帥

（皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院燒傷整形外科，安徽 蕪湖 241001）

燒傷病房鮑曼不動桿菌耐藥性及OXA基因型檢測

呂大倫 陳 雷 丁 偉 徐姝娟 張 煒 王合麗 王 帥

（皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院燒傷整形外科，安徽 蕪湖 241001）

目的：了解燒傷病房患者創(chuàng)面鮑曼不動桿菌的耐藥性和OXA碳青霉烯酶基因攜帶情況，為預防和控制多重耐藥鮑曼不動桿菌醫(yī)院感染提供依據(jù)。方法：收集2013年1月—2015年12月皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院燒傷整形外科收治2 572例患者創(chuàng)面分泌物進行細菌培養(yǎng)；使用VITEK 2 Compact型全自動微生物檢測儀鑒定鮑曼不動桿菌，通過藥敏實驗檢測其對18種抗菌藥物的敏感性；應用聚合酶鏈反應(PCR)方法檢測4種OXA碳青霉烯酶基因(OXA-23-like、OXA-24-like、OXA-51-like、OXA-58-like)的攜帶情況，并對其中10株進行OXA-23-like基因測序。結果:分離出44株鮑曼不動桿菌，對亞胺培南耐藥率為79.55%（27株），對米諾環(huán)素及替加環(huán)素的耐藥率較低，分別為20.45%（9株）和31.82%（14株)，對慶大霉素耐藥率高達100%，對其他抗菌藥物也具有較高的耐藥率(59.09%～97.73%)。所有菌株OXA-51-like基因均為陽性，共有35株OXA-23-like基因陽性（陽性率79.55%），均未檢測到OXA-24-like基因和OXA-58-like基因。結論：鮑曼不動桿菌呈多重耐藥現(xiàn)象，對米諾環(huán)素耐藥率最低，我院創(chuàng)面鮑曼不動桿菌主要耐藥機制可能與OXA-23-like基因有關。

鮑曼不動桿菌 OXA基因 耐藥性 碳青霉烯酶

鮑曼不動桿菌是一種革蘭陰性桿菌，它具有非發(fā)酵性和氧化酶陰性，且自身沒有動力。鮑曼不動桿菌引起的燒傷患者創(chuàng)面感染率逐年升高，更引人擔憂的是其耐藥率逐年上升。碳青霉烯類抗菌藥物（亞胺培南和美羅培南等）是一類具有抗菌譜廣、殺菌活性強的抗生素，是臨床上治療鮑曼不動桿菌感染最重要的抗菌藥物。自從1991年首先在美國發(fā)現(xiàn)耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌以來，碳青霉烯類抗生素耐藥現(xiàn)象日益嚴峻，給臨床抗感染治療帶來嚴峻挑戰(zhàn)。為了解鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥性及其耐碳青霉烯酶基因OXA與耐藥性的關系，本研究分析了來自我院燒傷整形科44例燒傷患者的44株鮑曼不動桿菌的耐藥情況，并進一步研究耐碳青霉烯酶基因OXA的攜帶情況。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 電泳儀、PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)（BioRad公司），比濁儀、藥物敏感檢測卡和VITEK 2 Compact型全自動微生物檢測儀（法國生物梅里埃公司），DNAMakerⅢ(北京天根生化科技有限公司)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；DNA凝膠回收試劑盒(杭州愛思進生物技術有限公司)，DL l 000 DNA Marker及TA克隆試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2 菌株來源和鑒定 我院燒傷整形外科病房2013年1月—2015年12月共收治2 572例患者，患者于入院后立即或住院后發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面出現(xiàn)膿性分泌物時采集創(chuàng)面分泌物，送檢驗科細菌培養(yǎng)，VITEK 2 Compact型全自動微生物檢測儀進行菌種鑒定，從44例患者的90個創(chuàng)面中共分離出44株鮑曼不動桿菌。44例患者中男28例，女16例；年齡2～85歲，平均（53.11±18.13）歲。感染創(chuàng)面包括糖尿病足創(chuàng)面、燒創(chuàng)傷創(chuàng)面、壓瘡創(chuàng)面及其他創(chuàng)面。

1.3 病原微生物培養(yǎng)和藥物敏感試驗 44株非重復鮑曼不動桿菌分離后于-80 ℃冰箱保存，所有菌株進行藥物敏感試驗。質(zhì)控菌株購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心，分別為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853，參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》，應用全自動微生物檢測儀進行菌種鑒定和藥物敏感試驗?？咕幬镞x用頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢哌酮／舒巴坦、頭孢吡肟、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、亞胺培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、慶大霉素、阿米卡星、米諾環(huán)素、替加環(huán)素、復方新諾明，共18種。MIC結果判定參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會2013年標準（M100-S23），另外頭孢哌酮/舒巴坦的藥敏試驗采用K-B紙片擴散法，結果判斷參照M100-S23頭孢哌酮的標準[1]。

1.4 細菌DNA提取 采用煮沸法制備。制備后模板-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 OXA酶基因檢測 PCR擴增基因擴增引物參照文獻［2］設計，設計為OXA-23 OXA-23A* ： 5’-CTATTTTTGTCGTGTACAGAGC-3’；OXA-23B* ： 5’-GGATCACAACAACTAA AAGCACTG-3’。以PCR法，檢測OXA-23-like、OXA-23R，OXA-24-like、OXA-24R，OXA-51-like、 OXA-51R，OXA-58-like和OXA-58R。PCR反應體系體積30 μl。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 50 s，共 35個循環(huán)，72 ℃ 延伸10 min。標本4 ℃下保存。PCR擴增終末產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像儀下觀察結果并拍照。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用WHONET5.5軟件。細菌耐藥率=耐藥菌株數(shù)/總菌株數(shù)×100%。

2 結 果

2.1 藥敏實驗結果 鮑曼不動桿菌對臨床常用的18種常用抗生素的耐藥率分別是：頭孢唑林93.18%（41株），頭孢他啶75.00%（33株），頭孢曲松77.27%（34株），頭孢哌酮／舒巴坦59.09%（26株），頭孢吡肟79.55%（27株），氨芐西林84.09%（37株），氨芐西林/舒巴坦72.73%（32株），哌拉西林/他唑巴坦70.45%（31株），氨曲南86.36%（38株），亞胺培南79.55%（35株），環(huán)丙沙星79.55%（35株），左氧氟沙星81.82%（36株），莫西沙星77.27%（34株），慶大霉素100%（44株），阿米卡星97.73%（43株），米諾環(huán)素20.45%（9株），替加環(huán)素31.82%（14株），復方新諾明77.27%（34株）。

2.2 OXA酶基因檢測結果 PCR檢測44株臨床分離的鮑曼不動桿菌的4類OXA型耐藥基因（OXA-23-like、OXA-24-like、OXA-51-like、OXA-58-like），發(fā)現(xiàn)所有菌株OXA-51-like基因均為陽性，其中35株（79.55%）OXA-23-like基因陽性，44株鮑曼不動桿菌均未檢測到OXA-24-like基因和OXA-58-like基因。見圖 1。

圖1 鮑曼不動桿菌菌株4種OXA酶基因凝膠電泳

2.3 OXA-23-like基因全序列PCR 在35株OXA-23-like基因陽性的菌株中隨機挑選10株進行OXA-23-like基因全序列PCR擴增，PCR實驗及瓊脂糖電泳結果顯示有9株菌擴增出OXA-23-like基因的全序列，1株未擴增出OXA-23-like基因。見圖2。

圖2 全序列OXA-23-like基因凝膠電泳

3 討 論

從我院近3年燒傷病房患者創(chuàng)面鮑曼不動桿菌耐藥檢測分析，我院燒傷病房患者創(chuàng)面鮑曼不動桿菌耐藥現(xiàn)象非常嚴峻，尤其對臨床上常用的碳青霉烯類抗生素也有較高的耐藥率。本組資料中，鮑曼不動桿菌對亞胺培南的耐藥率達79.55%，僅對米諾環(huán)素（耐藥率20.45%）、替加環(huán)素（耐藥率31.82%）具有較高敏感性[3]。提示應該加強防控，減少患者鮑曼不動桿菌感染機會，減輕耐藥狀況。

質(zhì)粒介導的 OXA58型青霉烯酶于2003年被首次報道, OXA-23是最早被鑒定出的OXA-23-like型碳青霉烯酶，首次被發(fā)現(xiàn)于一株亞胺培南耐藥的鮑曼不動桿菌中。OXA23是鮑曼不動桿菌對亞胺培南耐藥最主要的碳青霉烯酶[4]，鮑曼不動桿菌可能是通過產(chǎn)生能水解碳青霉烯類藥物的OXA23基因，通過質(zhì)粒介導的 OXA23基因引起多重耐藥。OXA-23-like酶屬于D類碳青霉烯酶家族[1]，由于此類酶的編碼基因常位于鮑曼不動桿菌的質(zhì)粒上，極易通過質(zhì)粒介導的耐藥基因轉(zhuǎn)移機制造成克隆播散，目前OXA-23已在世界范圍內(nèi)廣泛流行[5]。

本實驗檢測了燒傷患者的44株鮑曼不動桿菌的4組OXA基因，發(fā)現(xiàn)所有菌株均攜帶有OXA-51-like基因（100%），有35株OXA-23-like基因陽性（79.55%），44株鮑曼不動桿菌OXA-24-like基因和OXA-58-like基因的PCR實驗均為陰性；結果說明我院燒傷病房鮑曼不動桿菌的OXA基因流行基因型除了天然攜帶的OXA-51-like基因外，以OXA-23-like基因為主[6-7]。本實驗的菌株不論是否對碳青霉烯類抗生素耐藥均檢測到OXA-51-like基因，與以往研究認為OXA-51-like基因為鮑曼不動桿菌固有的耐藥基因的結論相符，也說明了鮑曼不動桿菌是否耐碳青霉烯類抗菌藥物與OXA-51-like基因的存在不相關，由于OXA-51-like基因的表達有賴于基因上游存在插入序列ISAbal，并且OXA-51-like酶對碳青霉烯類抗生素具有較弱的水解能力[8]，說明OXA-51-like基因可能不是導致鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因。

通過分析藥敏試驗可知臨床醫(yī)師治療由多重耐藥鮑曼不動桿菌引起的感染時，可選用的抗菌藥物非常有限，應引起高度重視。同時鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯類抗菌藥物可能是由其攜帶了OXA-23-like耐藥基因造成，所以醫(yī)生要了解本科室患者鮑曼不動桿菌的耐藥特性，加強OXA-23-like耐藥基因的檢測及監(jiān)控，防止OXA-23-like耐藥基因在病房和醫(yī)院內(nèi)的流行播散；同時加強臨床聯(lián)合用藥的意識，合理選用抗菌藥物。

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Detection of drug resistance and OXA genotypes in Acinetobacter baumannii isolated from patients of burn units

Lv Dalun, Chen Lei ,Ding Wei, Xu Shujuan, Zhang Wei, Wang Heli, Wang Shuai. Department of Burns and
Plastic Surgery, the First Affiliated Hospital, Wannan Medical College, Wuhu 241001, Anhui, China

Objective: To investigate the drug resistance and OXA gene carrying case of Acinetobacter baumannii isolated from burn patients to provide a basis for prevention and control of hospital infection induced by multi-drug resistant Acinetobacter baumannii. Methods: Bacterial culture of wound secretion was performed in 2 572 burn patients admitted to the Burns and Plastic Surgery of the First Affiliated Hospital of Wannan Medical College from January 2013 to February 2015. VITEK 2 Compact automatic microbial detection system was used to identify Acinetobacter baumanii, and its susceptibility to 18 kinds of antimicrobial were tested. Four kinds of OXA carbapenemase genes (OXA-23-like, OXA-24-like, OXA-51-like, OXA-58-like) in Acinetobacter baumannii were detected by polymerase chain reaction, and OXA-23-like gene was sequenced in 10 strains. Results: Totally 44 strains of Acinetobacter baumannii were isolated, and the resistance rate to imipenem was 79.55% ( 27 strains), they were lower to Minocyline and tigecycline (20.45%, 9 strains and 31.82%,14 strains respectively) , but high (100%) to gentamicin, and maintained at higher resistance rate to other antibiotics (59.09%-97.73%). In all strains of Acinetobacter baumannii, the OXA-51-like genes were positive, and a total of 35 OXA-23-like genes-positive strains (79.55%) were detected, while no OXA-24-like gene and OXA-58-like gene positive strains were found. Conclusions: Acinetobacter baumannii showed multiple drug resistance, the resistance rate to minocycline is low. The mechanism of multi-drug resistance of Acinetobacter baumannii in our hospital may be related mainly to OXA-23-like genes.

Acinetobacter baumannii; OXA genes; Drug resistance; Carbapenemase

2016-12-05)

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 04. 004

安徽省蕪湖市科技惠民計劃（2012hm30）