牛奶中抗生素類獸藥殘留快速檢測(cè)的研究進(jìn)展

黃闖，吳勤民，孫芝楊，邵虎，孔令偉

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇省食品加工工程技術(shù)研究開發(fā)中心，江蘇淮安223003；2.淮安快鹿牛奶有限公司，江蘇淮安223001）

牛奶中抗生素類獸藥殘留快速檢測(cè)的研究進(jìn)展

黃闖1，吳勤民1，孫芝楊1，邵虎1，孔令偉2

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇省食品加工工程技術(shù)研究開發(fā)中心，江蘇淮安223003；2.淮安快鹿牛奶有限公司，江蘇淮安223001）

介紹抗生素類獸藥殘留的原因及危害，并討論了磺胺類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、硝基呋喃類幾種常見(jiàn)抗生素最新檢測(cè)方法，最后對(duì)樣品前處理和檢測(cè)兩個(gè)階段的方法做出了總結(jié)及展望。

抗生素；樣品前處理；檢測(cè)方法；殘留

獸藥殘留可分為抗生素類、驅(qū)腸蟲藥類、生長(zhǎng)促進(jìn)劑類、抗原蟲藥類、滅錐蟲藥類、鎮(zhèn)靜劑類和β2腎上腺素能受體阻斷劑。其中抗生素類殘留危害巨大，已經(jīng)引起世界各國(guó)和國(guó)際團(tuán)體的高度重視。人長(zhǎng)期攝入

含抗生素殘留的動(dòng)物性食品后，可造成藥物積累，甚至產(chǎn)生耐藥性，破壞胃腸道菌群環(huán)境，造成生態(tài)毒害。因此，食品中，特別是牛奶中抗生素殘留的快速檢測(cè)越來(lái)越受到人們的重視。

1 抗生素類獸藥殘留的原因及危害

獸藥是用于預(yù)防和治療畜禽疾病的藥物。動(dòng)物性食品中的獸藥殘留對(duì)人的潛在危害[1-3]愈來(lái)愈引起人們的重視：動(dòng)物在反復(fù)接觸抗生素等抗菌藥物后，動(dòng)物體內(nèi)的耐藥菌株會(huì)大量繁殖并傳播給人，給臨床治療帶來(lái)困難[4]；四環(huán)素、鏈霉素等藥物及環(huán)境中的化學(xué)藥品可引起致畸、致突變、致癌、生殖毒性等特殊毒性作用[5]；氯霉素、大環(huán)內(nèi)酯類藥物[6]等對(duì)人體產(chǎn)生的有害或不良生物學(xué)改變，導(dǎo)致急性、亞急性或慢性毒性作用；青霉素類等藥物其代謝和降解產(chǎn)物產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)，引起皮炎、皮膚瘙癢、過(guò)敏性休克，或危及生命；具性激素樣活性的化合物作為同化劑用于畜牧業(yè)生產(chǎn)，其殘留會(huì)影響人的正常性激素功能，甚至發(fā)生腫瘤。因此，快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、多殘留同時(shí)檢測(cè)的技術(shù)研究非常關(guān)鍵[7-12]。獸藥殘留種類很多，按用途可以分為抗生素類、合成抗菌素類、抗寄生蟲類藥、生長(zhǎng)促進(jìn)劑和殺蟲劑等。其中乳中抗生素殘留日益受到關(guān)注[13]。

2 磺胺類藥物殘留檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

目前動(dòng)物性食品中磺胺類藥物殘留[14]的檢測(cè)方法主要包括微生物檢測(cè)法、分光光度計(jì)法、免疫分析法、色譜法及色/質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等[15]?；前肥且活惥哂袑?duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的藥物，在動(dòng)物體內(nèi)分布廣泛，血液中含量居首，肝、腎次之。磺胺通過(guò)干擾細(xì)菌的葉酸代謝而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。孫晶瑋等[16]利用超聲波提取，采用氯仿-丙酮進(jìn)行液-液萃取處理，利用RP-HPLC、甲醇-水-乙酸為流動(dòng)相進(jìn)行直接分析，添加回收率達(dá)到81.98%～104.16%，標(biāo)準(zhǔn)偏差小于9.0%；胡海燕等[17]建立了牛奶中多種磺胺類藥物殘留檢測(cè)的UPLC法，定量限為50μg/kg。郭偉等[18]建立同時(shí)測(cè)定牛乳中24種磺胺類藥物多殘留的UPLC-ESI-MS/MS分析方法。樣品提取和凈化采用的是經(jīng)改良的QuEChERS技術(shù)，樣品的平均回收率在64.2%～110.9%之間。倪姮佳[19]以生物素化的核酸適配體（biotin-SA07）為識(shí)別工具，合成出酶標(biāo)抗原SM2-GA-HRP，建立了用于檢測(cè)磺胺二甲嘧啶的直接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光分析方法。該方法的檢測(cè)限為0.92 ng/mL，線性范圍為1.85 ng/mL～21.57 ng/mL。

3 氟喹諾酮類（FQs）藥物殘留檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

氟喹諾酮類（FQs）藥物合成抗菌藥，抑制脫氧核糖核酸螺旋酶，阻礙細(xì)菌DNA復(fù)制，有廣譜殺菌作用，副作用小[20-24]。FQs[25]大多不溶于非極性有機(jī)溶劑，易溶于冰醋酸、稀礦酸或稀堿溶液，對(duì)光不穩(wěn)定。樣品前處理方法包括液液分配、固相萃取、基質(zhì)固相分散、在線透析等。液液分配是利用藥物在有機(jī)相和水相間不同分配系數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)移，除去干擾物質(zhì)，如用氯仿或乙酸乙酯提取后，用堿性緩沖液抽提分析物，酸化后再用氯仿或乙酸乙酯提取水相。固相萃取（SPE）吸附劑一般為C18、氧化鋁、氨丙基磺酸型和丙磺酸型離子交換樹脂。在線透析和富集可以使藥物分子穿過(guò)透析膜進(jìn)入欲富集柱中用淋洗劑洗去雜質(zhì)，再用洗脫劑洗脫至分析柱中而分離。FQs的檢測(cè)方法主要包括生物測(cè)定法、分光光度法、色譜法及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等[26]。米鐵軍[27]建立了牛奶中FQs藥物多殘留檢測(cè)的熒光偏振免疫分析方法，該方法是通過(guò)檢測(cè)熒光標(biāo)記抗原（和待測(cè)物）在與特異性的抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合前后FP值的變化，來(lái)定量計(jì)算小分子待測(cè)物的含量。孟哲[28]采用超高效液相色譜-四極桿-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，快速篩查、定量分析乳制品中8種FQs藥物殘留，以體積比100∶1的乙腈-20%三氯乙酸溶液作溶劑和OasisHLB固相萃取凈化，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的同時(shí)提取和有效凈化。邢廣旭[29]結(jié)合了膠體金標(biāo)記技術(shù)與免疫膜層析技術(shù)，合成人工結(jié)合全抗原，可在1min～5min內(nèi)判定樣品中是否有FQs。

4 四環(huán)素類藥物殘留檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

四環(huán)素類包括四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素等，是一類堿性光譜抗生素，與細(xì)菌核蛋白體30S亞基在A位特異性結(jié)合，阻止氨酰tRNA在該位置上的聯(lián)結(jié)，阻止肽鏈延伸和細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，改變細(xì)胞膜通透性，抑制DNA復(fù)制。四環(huán)素[30]在0.03mol/L鹽酸溶液中能保持長(zhǎng)期穩(wěn)定。牛奶等液體樣品一般通過(guò)離心去除部分蛋白和顆粒，再用乙酸鹽、磷酸鹽、McIlvaine或McIlvaine/EDTA、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽緩沖液、三氯乙酸等稀釋。另可用超濾法提取牛奶。再進(jìn)行液液分配、固相萃?。⊿PE）、基質(zhì)固相分散、超濾、免疫親和色譜和在線痕量富集等凈化處理。液液分配利用二氯甲烷等疏水性有機(jī)溶劑將脂溶性雜質(zhì)洗去；SPE柱固定相多為C18、多聚類和環(huán)己基，另可將反相柱與陽(yáng)離子交換柱串聯(lián)使用，或混合填料使用；基質(zhì)固相分散采用C18，搭配同份量的EDTA和草酸，可加快提取速度。乙睛一乙酸乙醋溶液洗脫，高效液相色譜（HPLC）法檢

測(cè)，回收率范圍是63.5%～93.3%，變異系數(shù)小于10%[31]。其他測(cè)定方法還有微生物測(cè)定法、薄層色譜、熒光分光光度法和毛細(xì)管電泳法。Stolker等[32]對(duì)牛奶中四環(huán)素類獸藥殘留進(jìn)行了測(cè)定，采用StrataX SPE柱進(jìn)行前處理，LC-TOF-MS進(jìn)行測(cè)定。Koesukwiwat等[33]采用HLB柱進(jìn)行凈化，對(duì)牛奶中磺胺和四環(huán)素類獸藥進(jìn)行了檢測(cè)，回收率為72.0%～97.4%，定量限為0.6 ng/mL～8.6 ng/mL。蘇璞[34]建立了高通量的四環(huán)素類抗生素殘留檢測(cè)的懸浮芯片技術(shù)，檢測(cè)限為0.05 ng/mL～781.25 ng/mL。

5 硝基呋喃類藥物殘留檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

硝基呋喃類藥物及其代謝物對(duì)人體有致癌、致畸等作用，1995年起歐盟禁止其在水產(chǎn)和畜禽食品中使用。該類藥物代謝產(chǎn)物因與蛋白質(zhì)結(jié)合穩(wěn)定，故一般通過(guò)代謝物檢測(cè)反映其原形藥殘留情況。牛奶等樣品先用氯化鈉稀釋，或冷凍脫水，再用乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷進(jìn)行提取。凈化處理包括液液分配、固相萃?。⊿PE）、基質(zhì)固相分離等。液液分配可在酸性條件下用二氯甲烷提取，加入氯化鈉，效果會(huì)更好，加入正己烷可去脂質(zhì)；固相萃取以C18、XAD-2應(yīng)用最多；基質(zhì)固相分離以C18用的最多。測(cè)定方法有薄層和液相色譜法，紫外、熒光、電化學(xué)或質(zhì)譜檢測(cè)。陶燕飛[35]建立了牛奶中硝基吠喃類藥物代謝物的LC-MS/Ms定量確證方法。樣品采用ASE提取，溶劑為甲醇/三氯乙酸，再用鄰硝基苯甲醛超聲衍生，用乙酸乙酯提取，HLB凈化，分析物采用高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜定性檢測(cè)。

6 結(jié)束語(yǔ)

為了人類和動(dòng)物的健康，國(guó)際組織及多國(guó)均制定了嚴(yán)格的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法[36]。獸藥殘留分析包括樣品前處理和檢測(cè)兩個(gè)階段[37]。前處理是除去蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)，并進(jìn)行凈化處理，使樣品濃縮、穩(wěn)定，以便于檢測(cè)。常用的提取方法有：振蕩法、索氏提取法、超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取法、快速溶劑萃取法等。凈化主要包括液液萃取和固相萃取。目前樣品前處理的趨勢(shì)在于簡(jiǎn)化前處理過(guò)程。多殘留分析要求應(yīng)用簡(jiǎn)單、通用的樣品前處理過(guò)程，使之能夠適用于具有不同物理化學(xué)特性的多類別組分。QuEChERS方法也已用于不同食品中多類別獸藥組分的測(cè)定，具有快速（quick）、簡(jiǎn)單（easy）、便宜（cheap）、高效（effective）、耐用（rugged）和安全（safe）的優(yōu)點(diǎn)，一般用乙腈提取，通過(guò)用氯化鈉和硫酸鎂鹽析的方法移除水分和蛋白質(zhì)，以分散固相萃取的方式凈化，最后通過(guò)LC-MS測(cè)定從極性到非極性的所有化合物。檢測(cè)以HPLC和HPLC-MS/MS為主，多類別、多組分獸藥的同時(shí)同步分析成為近年來(lái)獸藥殘留分析的發(fā)展趨勢(shì)。液相色譜串聯(lián)三級(jí)四極桿質(zhì)譜和液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜在獸藥多殘留分析中各有特色。隨著消費(fèi)者對(duì)無(wú)抗概念的興趣日漸濃厚，開發(fā)快速、靈敏度高的抗生素檢測(cè)方法也已經(jīng)成為企業(yè)所面臨的難題，也只有這樣才能不斷提高乳品的質(zhì)量和企業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)力。

[1]Garcla-Galan M J,Dlaz-Cruz SM,Kotarski S,etal.Identification and determination ofmetabolites and degradation products of sulfonamide antibiotics[J].Trends Anal.Chem,2008,27(11):1008-1022

[2]Kennedyk K A,Rockwell S,Stark CA,et al.Preferential activation ofmitomycin C to cytotoxicmetabolites by hypoxic tumor cells[J]. CancerRes,1980,40(7):2356-2360

[3]MacfarlaneGT,Macfarlane S.Human colonic microbiota:Ecology,physiology and metabolic potential of intestinal bacteria[J]. Scand JGastroenterol,1997,32(222):3-9

[4]師邱毅,紀(jì)其雄,許莉勇.食品安全快速檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:44

[5]方曉明,丁卓平.動(dòng)物源食品獸藥殘留分析[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2008:9

[6]食品加工在線.動(dòng)物性食品中抗生素殘留的來(lái)源和危害[OL]．[2016-02-24]．http://www.sjgle.com/news/show-4013.html

[7]周思,肖小華,李攻科.食品安全快速檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].色譜,2011,29(7):580-586,593

[8]Agarwal VK.High-performance liquid chromatographicmethods for the determination of sulfonamides in tissue,milk and eggs[J].JournalofChromatography,1992,624(1/2):411-423

[9]Gamba V,Terzano C,Fioroni L,etal.Developmentand validation of a confirmatory method for the determination of sulphonamides in milk by liquid chromatography with diode array detection[J].Anal. Chim Acta,2009,637(1/2):18-23

[10]Tittlemier S,Gelinas JM,DufresneG,etal.Developmentofa direct competitive enzyme-linkedmmunosorbent assay for the detection of fluoroquinolone residues in shrimp[J].Food AnalyticalMethods, 2008,1(1):28-35

[11]Pecorelli I,GalariniR,BibiR,etal.Simultaneousdetermination of 13 quinolones from feeds using accelerated solvent extraction and liquid chromato-graph[J].Anal.Chim.Acta,2003,483(1/2):81-89

[12]曲斌,陳蓉,耿士偉,等.液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在獸藥多類別、多組分殘留分析中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2015,6(5): 1654-1660

[13]陳云,李洪亮,張冬潔,等.乳中抗生素殘留及其檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].中國(guó)乳品工業(yè),2012,40(9):35-38

[14]甘青寧色譜協(xié)作中心、甘肅省化學(xué)會(huì)色譜專業(yè)委員會(huì).西北地區(qū)

第六屆色譜學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)甘肅省第十一屆色譜年會(huì)論文集[C].甘青寧色譜協(xié)作中心、甘肅省化學(xué)會(huì)色譜專業(yè)委員會(huì):,2010:9

[15]趙書景,賀紹君,羅國(guó)琦,等.動(dòng)物性食品中磺胺類藥物殘留檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2009,36(8):60-63

[16]孫晶瑋,趙新淮.RP—HPLC快速分析牛奶中六種磺胺類抗生素殘留[J].食品工業(yè)科技,2008,29(4):274-276,278

[17]胡海燕,徐倩,孫雷,等.豬肉和牛奶中10種磺胺類藥物殘留檢測(cè)超高效液相色譜法研究[J].中國(guó)獸藥雜志,2009,43(8):1-4

[18]郭偉,劉永,劉寧,等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析牛乳中24種磺胺類藥物殘留[J].分析化學(xué)研究報(bào)告,2009,37(11):1638-1644

[19]倪姮佳.恩諾沙星和磺胺二甲嘧啶核酸適配體的篩選及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法的研究[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),2014

[20]Blondeau JM.Fluoroquinolones:Mechanism ofaction,classification, and developmentof resistance[J].Survey ofOphttalmology,2004,49 (2):73-78

[21]Marks KR.Investigation the fluoroquinolone-topoisomerase interaction by use of novel fluoroquinolone and quinazoline analogs[D]. United States:TheUniversityof Iowa,2011:65-68

[22]Minovski N,Vracko M,Solmajer T.Quantitative structure-activity relationship study of antitubercular fluoroquinolones[J].Molecular Diversity,2011,15(2):417-426

[23]VolgyiQVizseralek G,Takacs-Novak K,Avdeef A,etal.Predicting the exposure and antibacterial activity of fluoroquinolonesbased on physicochemical properties[J].European Journal of Pharmaceutical Sciences,2012,47(1):21-27

[24]Mottola C,Freitas FB,SimoesM,etal.In vitro antiviral activity of fluoroquinolonesagainstAfrican swine fevervirus[J].VeterinaryMicrobiology,2013,165(1/2):86-94

[25]HANRong-wei,ZHENGNan,WANG Jia-qi,etal.Survey of tetracyclines,sulfonamides,sulfamethazine,and quinolones in UHTmilk in Chinamarket[J].Journal of Integrative Agriculture,2013,12(7): 1300-1305

[26]夏清海.氟喹諾酮類抗生素分析新方法及其應(yīng)用的研究[D].昆明:昆明理工大學(xué),2014:96-97

[27]米鐵軍.動(dòng)物性食品中喹諾酮類藥物殘留的熒光偏振免疫分析研究[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),2013:107-108

[28]孟哲.動(dòng)物源食品中抗生素及其代謝物快速篩查與多殘留定量分析方法學(xué)研究[D].保定:河北大學(xué),2015:111-112

[29]邢廣旭.氟喹諾酮類藥物多殘留免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究[D].鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2013:74

[30]Determination of fluoroquinolones,sulfonamides,and tetracyclines multiresiduessimultaneously in porcine tissuebyMSPD and HPLCDAD[J].JournalofPharmaceutical Analysis,2012,2(1):76-81

[31]余歡.動(dòng)物可食性組織中獸藥多殘留檢測(cè)關(guān)鍵技術(shù)研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2010:41-43

[32]Stolker AA,RutgersP,Oosterink E,etal.Comprehensive screening and quantification ofveterinary drugs inmilk using UPLC-ToF-MS [J].Analyticaland BioanalyticalChemistry,2008,391(6):2309-2322

[33]Koesukwiwat U,Jayanta S,Leepipatpiboon N.Validation of a liquid chromatography-mass Spectrometry multi-residue method for the simultaneous determination of sulfonamides,tetracyclines,and pyrimethamine inmilk[J].Journalof Chromatography A,2007,1140 (1/2):147-156

[34]蘇璞.牛奶中多種抗生素的懸浮芯片檢測(cè)技術(shù)研究[D].北京:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,2011:76

[35]陶燕飛.動(dòng)物源食品中獸藥殘留多組分定量/確證方法的關(guān)鍵技術(shù)研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2011:52

[36]周錦帆.各國(guó)食品和飼料中農(nóng)藥獸藥殘留限量大全[J].現(xiàn)代商檢科技,1994(6):8

[37]陳冬梅.動(dòng)物性食品中獸藥殘留定量和確證分析關(guān)鍵技術(shù)研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2010:11

Research Progress on Rapid Detection of Antibiotic Residues in M ilk

HUANGChuang1，WUQin-min1，SUN Zhi-yang1，SHAOHu1，KONG Ling-wei2
（1.Food Processing Engineering Technology Research and DevelopmentCenterof Jiangsu Province，Jiangsu Food and Drug Vocationaland TechnicalCollege，Huai'an 223003，Jiangsu，China；2.HUAIAN KUAILU MILKCO.，LTD.，Huai'an 223001，Jiangsu，China）

The causeand harm of Antibiotic residuesofveterinary drugswere introduced.Therearenew detectionmethodsofseveral common antibiotics，which contain sulfonamides，quinolones，tetracyclines，nitrofuran arealso discussed.At last，themethodsofsamplepretreatmentand detection aresummarized and expected.

antibiotics；samplepretreatment；detectedmethods；residues

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.051

2016-08-22

黃闖（1981—），男（漢），講師，碩士，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全。