肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗難點剖析

甘肅 張仲林

肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗難點剖析

甘肅 張仲林

肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗是現(xiàn)行人教版高中生物必修2教材中證明DNA是遺傳物質(zhì)的證據(jù)的經(jīng)典實驗，也是高考命題的熱點之一。教材中簡練的文字、圖解及深奧的轉(zhuǎn)化理論，給學(xué)生留下了一些難點。為了幫助學(xué)生更好地理解這個實驗，現(xiàn)對這些難點作一些探討。

一、莢膜的成分及作用

莢膜是某些細(xì)菌細(xì)胞壁外的一層較松厚而且較固定的黏液性物質(zhì)，主要由水、多糖或多肽組成。莢膜的作用有：

（1）防止細(xì)菌變干。這是由于莢膜中含有水分。

（2）吸附陽離子。有些莢膜含有羧基基團(tuán)，能吸附陽離子。

（3）防止噬菌體的侵襲。

（4）防止被吞噬細(xì)胞吞噬和消化。

（5）許多細(xì)菌通過莢膜相互連接，形成體積較大的菌膠團(tuán)，這在防止被吞噬細(xì)胞吞噬中起著重要作用。

S型細(xì)菌的菌體有莢膜，R型細(xì)菌的菌體無莢膜。S型細(xì)菌能侵染和寄生在人體內(nèi)，引起肺炎，也能侵染其他哺乳類動物如兔、馬，還能侵染家鼠，引起敗血癥。

S型細(xì)菌的菌體有莢膜，進(jìn)入機(jī)體后，受莢膜的保護(hù)，能抵抗吞噬細(xì)胞的吞噬和消化作用，從而迅速繁殖、擴(kuò)散，能引起機(jī)體發(fā)生疾病，嚴(yán)重時引起死亡。這就是肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗中將有毒性的S型活細(xì)菌注射到小鼠體內(nèi)，小鼠患敗血癥死亡的原因。

R型細(xì)菌無莢膜，能被吞噬細(xì)胞吞噬、消化，所以不能使機(jī)體患病。這也就是肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗中將無毒性的R型活細(xì)菌注射到小鼠體內(nèi)，小鼠不死亡的原因。

致病與否，關(guān)鍵是看細(xì)菌有無莢膜。

二、轉(zhuǎn)化的概念及條件

轉(zhuǎn)化是受體菌直接吸收供體菌的DNA片段而獲得供體菌部分遺傳性狀的現(xiàn)象。

S型肺炎球菌和小鼠不是同種。自然條件下肺炎球菌和小鼠的細(xì)胞間遺傳物質(zhì)是不會轉(zhuǎn)移的。這就是肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗中將加熱殺死后的S型細(xì)菌注射到小鼠體內(nèi)，小鼠不死亡的原因。

并非任意兩株R型菌和S型菌之間的接觸都能發(fā)生轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)，凡能發(fā)生轉(zhuǎn)化的R型菌必須處于感受態(tài)。感受態(tài)是指受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并能實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)。它雖受遺傳控制，但表現(xiàn)卻差別很大。外界環(huán)境因子如環(huán)腺苷酸（cAMP）和Ca2＋對感受態(tài)有重要影響。如cAMP可使嗜血桿菌屬的細(xì)菌感受態(tài)水平提高1萬倍。

處于感受態(tài)的R型細(xì)菌分泌感受態(tài)因子，其中有細(xì)胞壁自溶素，使R型細(xì)菌的局部細(xì)胞壁溶解掉，從而使其細(xì)胞膜表面的膜連DNA結(jié)合蛋白和核酸酶暴露出來。

轉(zhuǎn)化因子是離體的DNA片段。一般原核生物的擬核是由一個大型的環(huán)狀DNA分子反復(fù)折疊盤繞而成的。但不管在自然條件或人為條件下，都極易斷裂成碎片。由于每個細(xì)胞表面能與轉(zhuǎn)化因子相結(jié)合的位點有限，所以轉(zhuǎn)化的頻率極低，通常為0.1%～1%。

三、加熱殺死的S型細(xì)菌中的DNA是否具有遺傳效應(yīng)？

S型細(xì)菌加熱到一定程度（60～100℃），其蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)受到破壞而喪失生物活性，加熱引起的蛋白質(zhì)變性是導(dǎo)致S型細(xì)菌死亡的原因。被加熱殺死的S型細(xì)菌通過自溶過程，釋放出部分DNA片段。有些DNA片段中含有控制莢膜合成的基因。但60～100℃的溫度只能使DNA的氫鍵斷開、雙螺旋解體，而不會引起DNA分子的降解和一級結(jié)構(gòu)的破壞。由于堿基互補(bǔ)配對作用，當(dāng)溫度逐漸降低后，分離的DNA單鏈會重新聚合、雙螺旋結(jié)構(gòu)重新恢復(fù)。因此，在一定溫度范圍內(nèi)，加熱殺死的S型細(xì)菌中的DNA是具有遺傳效應(yīng)的。

基因工程中采用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時，模板DNA經(jīng)加熱至90～95℃一定時間后，使模板雙鏈DNA解離，成為單鏈；模板DNA與引物退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至37～60℃，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列結(jié)合也利用了加熱這一原理。

四、加熱殺死后的S型細(xì)菌中的DNA是否進(jìn)入了R型活細(xì)菌的細(xì)胞中？

1928年，英國科學(xué)家格里菲思將加熱殺死后的S型細(xì)菌和R型活細(xì)菌混合后注射到小鼠體內(nèi)，結(jié)果不僅有許多小鼠死于敗血癥，而且從死鼠血液中還發(fā)現(xiàn)了活的S型細(xì)菌。

1944年，美國科學(xué)家艾弗里發(fā)現(xiàn)，只有S型細(xì)菌的DNA組分能夠把R型細(xì)菌轉(zhuǎn)化成S型細(xì)菌，而且DNA的純度越高轉(zhuǎn)化的效率也越高。這說明，一種基因型細(xì)胞的DNA進(jìn)入了另一種基因型的細(xì)胞后，可引起穩(wěn)定的遺傳變異，DNA賦有特定的遺傳特性。

加熱殺死的S型菌的含有控制莢膜形成基因的DNA片段，與感受態(tài)受體菌R型細(xì)菌表面的膜連DNA結(jié)合蛋白相結(jié)合，其中一條DNA單鏈被核酸酶水解掉，另一條DNA單鏈進(jìn)入R型細(xì)菌細(xì)胞中，與R型細(xì)菌核區(qū)環(huán)狀DNA的同源區(qū)段配對重組，形成一小段雜合的DNA片段。

隨著雜合R型細(xì)菌的分裂增殖，后代會出現(xiàn)S型細(xì)菌和R型細(xì)菌兩種細(xì)菌。這些轉(zhuǎn)化成的S型細(xì)菌的后代也是有毒性的S型細(xì)菌，可見這種性狀的轉(zhuǎn)化是可以遺傳的。實質(zhì)上，R型細(xì)菌轉(zhuǎn)化成S型細(xì)菌屬于基因的重組。

通過轉(zhuǎn)化最初形成的S型細(xì)菌數(shù)量極少，但S型細(xì)菌在小鼠細(xì)胞中大量繁殖、擴(kuò)散，使小鼠患敗血癥死亡。

五、肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗證明了什么？

肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗是一個直接證據(jù)，證明性狀本身是不遺傳的。在肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗中，多糖類是不遺傳的，而遺傳物質(zhì)才是遺傳的。在當(dāng)時的實驗室技術(shù)條件下，做了肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗的格里菲思無法知道“轉(zhuǎn)化因子”是什么。后來才有了艾弗里的分離實驗，證實“轉(zhuǎn)化因子”就是DNA。

六、細(xì)菌的遺傳轉(zhuǎn)化只見于肺炎雙球菌嗎？

遺傳轉(zhuǎn)化是指同源或異源的游離DNA分子（質(zhì)粒和染色體DNA）被自然或人工感受態(tài)細(xì)胞攝取，并得到表達(dá)的水平方向的基因轉(zhuǎn)移過程。

自然轉(zhuǎn)化現(xiàn)象首先是在肺炎雙球菌中發(fā)現(xiàn)的，70多年來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多細(xì)菌屬中的某些種或某些株有自然轉(zhuǎn)化的能力。近十多年來的研究已表明，通過自然轉(zhuǎn)化進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移過程已不只是一種“實驗室現(xiàn)象”，而是廣泛存在于自然界，可能是自然界進(jìn)行基因交換的重要途徑。環(huán)境中（土壤、水體、沙粒等）是否發(fā)生自然轉(zhuǎn)化，主要取決于環(huán)境中是否存在具有轉(zhuǎn)化活性的DNA分子及可吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞。

研究表明，幾乎所有的生活細(xì)菌都可向環(huán)境中主動分泌或因細(xì)胞死亡裂解而釋放DNA，這些DNA分子可與固型物（土粒、沙粒子）結(jié)合而得到保護(hù)，免受降解，從而能長時間存留于環(huán)境中并具有轉(zhuǎn)化活性，另一方面，自然感受態(tài)作為許多細(xì)菌應(yīng)付不利生活條件的一種調(diào)節(jié)機(jī)制，在自然環(huán)境中的存在具有普遍性。

目前發(fā)現(xiàn)的具有轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的細(xì)菌除肺炎雙球菌外，還有枯草桿菌、葡萄球菌、根瘤菌、奈瑟氏菌、嗜血桿菌等細(xì)菌以及少數(shù)真菌。

轉(zhuǎn)化與兩種細(xì)菌的親緣關(guān)系有關(guān)，轉(zhuǎn)化一般只發(fā)生在同一物種或近緣物種之間。

在人工條件下的遺傳轉(zhuǎn)化，為許多不具有自然轉(zhuǎn)化能力的細(xì)菌（如大腸桿菌）提供了一條獲取外源DNA的途徑，也是基因工程的基礎(chǔ)技術(shù)之一。

【例1】肺炎雙球菌中的S型具有多糖類莢膜，R型則不具有。下列敘述錯誤的是 （ ）

A.培養(yǎng)R型活細(xì)菌時加S型細(xì)菌的多糖類物質(zhì)，能產(chǎn)生一些具莢膜的細(xì)菌

B.培養(yǎng)R型活細(xì)菌時加S型細(xì)菌DNA的完全水解產(chǎn)物，不能產(chǎn)生具莢膜的細(xì)菌

C.培養(yǎng)R型活細(xì)菌時加S型細(xì)菌的DNA，能產(chǎn)生具莢膜的細(xì)菌

D.培養(yǎng)R型活細(xì)菌時加S型細(xì)菌的蛋白質(zhì)，不能產(chǎn)生具莢膜的細(xì)菌

【解析】莢膜的形成是受基因控制的。培養(yǎng)R型活細(xì)菌時加S型細(xì)菌的多糖類物質(zhì)，沒有控制莢膜形成的基因，所以不能產(chǎn)生一些具莢膜的細(xì)菌，故A錯。S型細(xì)菌DNA的完全水解產(chǎn)物中也無控制莢膜形成的基因，不能產(chǎn)生具莢膜的細(xì)菌，故B對。培養(yǎng)R型活細(xì)菌時加S型細(xì)菌的蛋白質(zhì)，因蛋白質(zhì)不是遺傳物質(zhì)，不能控制莢膜的形成，故D對。

【答案】A

【例2】肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗中，能夠證明DNA是遺傳物質(zhì)的實驗設(shè)計是 （ ）

A.將無毒R型活細(xì)菌與有毒S型活細(xì)菌混合后培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)R型細(xì)菌轉(zhuǎn)化成S型細(xì)菌

B.將無毒R型活細(xì)菌與加熱殺死的S型細(xì)菌混合后培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)R型細(xì)菌轉(zhuǎn)化成S型細(xì)菌

C.從加熱殺死的S型細(xì)菌中提取DNA、蛋白質(zhì)、多糖，分別加入培養(yǎng)R型細(xì)菌的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)R型細(xì)菌轉(zhuǎn)化成S型細(xì)菌

D.從S型活細(xì)菌中提取DNA、蛋白質(zhì)、多糖，分別加入培養(yǎng)R型細(xì)菌的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)只有加入DNA，R型細(xì)菌才轉(zhuǎn)化成S型細(xì)菌

【解析】在當(dāng)時的實驗室技術(shù)條件下，做了肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗的格里菲思無法知道“轉(zhuǎn)化因子”是什么。后來才有了艾弗里的探究實驗，艾弗里從加熱殺死的S型細(xì)菌中提取DNA、蛋白質(zhì)、多糖，分別加入培養(yǎng)R型細(xì)菌的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)R型細(xì)菌轉(zhuǎn)化成S型細(xì)菌的分離實驗，證實“轉(zhuǎn)化因子”就是DNA。

【答案】D

【例3】1944年美國科學(xué)家艾弗里（Avery）和他的同事從S型活細(xì)菌中提取出了DNA、蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)，然后將它們分別加入已培養(yǎng)了R型細(xì)菌的培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：只有加入了DNA，R型細(xì)菌才能轉(zhuǎn)化為S型細(xì)菌，而加入蛋白質(zhì)和多糖的培養(yǎng)基中，R型細(xì)菌不能發(fā)生這種變化。這一現(xiàn)象說明了：①S型細(xì)菌的性狀是由DNA決定的；②在轉(zhuǎn)化過程中，S型細(xì)菌的DNA進(jìn)入到了R型活細(xì)菌細(xì)胞中；③S型細(xì)菌的DNA是遺傳物質(zhì)；④R型細(xì)菌的DNA不是遺傳物質(zhì)；⑤蛋白質(zhì)和多糖不是遺傳物質(zhì)；⑥蛋白質(zhì)和多糖在該實驗中起對照作用 （ ）

A.①②④⑥ B.①②③④

C.①②③⑤⑥ D.①②③④⑤⑥

【解析】艾弗里（Avery）和他的同事從S型活細(xì)菌中提取出了DNA、蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)，然后將它們分別加入已培養(yǎng)了R型細(xì)菌的培養(yǎng)基中，觀察R型細(xì)菌的變化。并沒有提取出R型細(xì)菌DNA，所以不能得出R型細(xì)菌的DNA不是遺傳物質(zhì)的結(jié)論。

【答案】C

（作者單位：甘肅省渭源縣第三高級中學(xué)）