番茄ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化與驗(yàn)證

李永平，康建坂，林　琿（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心，福州500；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，福州500，福建省蔬菜工程技術(shù)研究中心，福州500）

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番茄ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化與驗(yàn)證

李永平1,2,3，康建坂1,2,3，林琿1,2,3
（1福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心，福州350013；2福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，福州350013，3福建省蔬菜工程技術(shù)研究中心，福州350013）

摘要：研究番茄ISSR-PCR反應(yīng)體系中主要因子TaqDNA聚合酶、dNTP、引物和DNA模板的濃度及各引物的退火溫度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響，建立番茄ISSR-PCR反應(yīng)的優(yōu)化體系，為ISSR技術(shù)在番茄分子輔助育種應(yīng)用提供參考。實(shí)驗(yàn)確定番茄ISSR-PCR 20 μL反應(yīng)體系為：2.0 μL 10×PCR緩沖液，0.3 μmol/L引物，50 ng模板DNA，0.5 mmol/LdNTP，2 U TaqDNA聚合酶，各引物最佳退火溫度有所不同。

關(guān)鍵詞：番茄；親緣關(guān)系；ISSR；優(yōu)化

0　引言

在生物技術(shù)研究領(lǐng)域中，分子技術(shù)一直是研究的熱點(diǎn)。ISSR結(jié)合了SSR和RAPD的優(yōu)點(diǎn)，克服了RFLP與RAPD的不足，簡(jiǎn)單方便，可以檢測(cè)到更高的種間遺傳差異，穩(wěn)定性也較高[1-3]。因此，ISSR標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性[4-6]、遺傳圖譜構(gòu)建[7-8]、種子純度鑒定[9-10]、植物分類(lèi)學(xué)[11]等研究中，但I(xiàn)SSR-PCR的擴(kuò)增效果受物種、反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序等的影響，不同作物最佳反應(yīng)體系差異較大。

番茄(Lycopersicon esculentum)因果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，具特殊風(fēng)味，是在全世界栽培最普遍的果菜之一，中國(guó)各地也普遍種植。1994年，加拿大蒙特利大學(xué)Zietkiewicze等[12]利用了RAPD技術(shù)優(yōu)點(diǎn)和基因組中豐富的SSR序列信息，提出了一種新的分子標(biāo)記技術(shù)（inter-simple sequence repeat，簡(jiǎn)單重復(fù)間序列，ISSR）。它可用少量DNA在沒(méi)有分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)的情況下構(gòu)建基因組指紋圖譜[13-15]，由于可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)SSR座位，重復(fù)性好，被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性[16-19]、種質(zhì)資源鑒定[12]、分子輔助育種[20]、基因定位[21]、種子純度鑒定[22-23]、植物分類(lèi)學(xué)[24]等方面。ISSR標(biāo)記能補(bǔ)充遺傳圖譜中一些RFLP標(biāo)記稀少、間斷或空白區(qū)，它在QTL定位中也逐漸得到較多的應(yīng)用[1-2]。ISSR是基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)，不同植物材料、實(shí)驗(yàn)材料及不同擴(kuò)增條件都將影響其擴(kuò)增效果[3-4]。

筆者對(duì)影響番茄ISSR-PCR反應(yīng)體系主要因素進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，旨在建立番茄ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系，為ISSR技術(shù)在番茄分子輔助育種應(yīng)用提供參考。

1　材料與方法

1.1供試材料

研究所用材料由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜中心提供，體系建立材料為番茄高代自交系T9，驗(yàn)證材料為38個(gè)番茄高代自交系。

主要試劑為10×PCR buffer（含Mg+，Tiangen公司產(chǎn)），TaqDNA聚合酶（Tiangen公司），dNTP（上海生工生物工程公司產(chǎn)），Mark2000（上海生工生物工程公司產(chǎn)）。ISSR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA的提取與檢測(cè)各番茄品種選取3株健壯、無(wú)病蟲(chóng)害、具有本品種特征特性的植株混合取樣，每株摘取1～2片幼小、舒展的心葉，用改進(jìn)的微量CTAB法[5-8]提取DNA。加入1μLRNase，37℃水浴30min，純化DNA。檢測(cè)各樣品的純度并計(jì)算其濃度，將各樣品濃度稀釋至50 ng/μL備用。用8 g/L瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)DNA的完整性。

1.2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的電泳分析擴(kuò)增反應(yīng)在GeneAmp PCR System 9600（Applera公司）上進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)采用20 μL體系：2.0 mmol/L MgCl2，2.0 μL10× PCR緩沖液，50 ng模板DNA，0.3 μmol/L引物，0.50 mmol/LdNTP，2.0 U TaqDNA聚合酶，加入超純水至20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，52.2℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用15 g/L的瓊脂糖凝膠在120 V穩(wěn)壓電泳50 min，EB染色15 min，在GDS 8000凝膠成像系統(tǒng)（UVP公司）上觀(guān)察并拍照。

1.2.3 ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)因素篩選及程序調(diào)整以番茄高代自交系T9 DNA為模板，ISSR引物823，對(duì)ISSR擴(kuò)增反應(yīng)其中一成分設(shè)置梯度進(jìn)行篩選時(shí)，保持其他成分的濃度不變，用雙蒸水調(diào)節(jié)保持總體積不變；擴(kuò)增程序中的退火溫度設(shè)計(jì)12個(gè)溫度梯度49.0、50.0、 51.0、51.5、52.0、52.2、52.5、52.8、53.0、54.0、55.0、56.0℃。

2　結(jié)果與分析

2.1 DNA模板濃度對(duì)番茄ISSR-PCR的影響

DNA模板是影響PCR擴(kuò)增重要因素，對(duì)模板DNA濃度進(jìn)行優(yōu)化非常必要。ISSR-PCR反應(yīng)中，DNA濃度太低可能無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，濃度過(guò)高則出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶甚至?xí)种茢U(kuò)增。反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)圖1，模板使用量在30～100 ng范圍內(nèi)5個(gè)不同量的DNA模板均有擴(kuò)增產(chǎn)物，DNA量在少于50 ng時(shí)，隨著DNA量增加條帶逐漸清晰，隨后DNA量增加條帶清晰度下降，當(dāng)DNA量增加到100 ng時(shí)條帶就有缺失，50 ng時(shí)條帶最為清晰。

圖1　DNA模板濃度對(duì)番茄ISSR-PCR的影響

2.2引物用量對(duì)番茄ISSR-PCR的影響

引物濃度影響引物與DNA模板配對(duì)概率，從而影響ISSR-PCR擴(kuò)增效率。引物濃度低，與DNA模板結(jié)合位點(diǎn)就少，擴(kuò)增產(chǎn)量就低；濃度過(guò)高，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，帶型彌散模糊。引物用量對(duì)番茄ISSR擴(kuò)增的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。用量為0.1、0.2、0.4、0.5 μmol/L時(shí)擴(kuò)增條帶比較模糊，用量0.3 μmol/L時(shí)條帶最清晰，因此，最終選用0.3 μmol/L為最佳用量。

2.3 dNTP濃度對(duì)番茄ISSR-PCR的影響

dNTP作為PCR反應(yīng)原料，濃度直接影響反應(yīng)產(chǎn)量與特異性。不同濃度的dNTP對(duì)番茄ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物的影響結(jié)果見(jiàn)圖3?？梢?jiàn)實(shí)驗(yàn)體系使用的濃度為0.25～0.625 mmol/L時(shí)隨濃度升高，條帶清晰度增加，濃度到0.75 mmol/L時(shí)，條帶模糊。濃度為0.5、0.625 mmol/L條帶較為清晰，考慮材料的成本，選擇dNTP濃度為0.5 mmol/L。

2.4 TaqDNA聚合酶濃度對(duì)番茄ISSR-PCR的影響

PCR擴(kuò)增效果直接受到TaqDNA聚合酶活性和用量影響。用量過(guò)少，酶過(guò)早消耗完，產(chǎn)物就少；用量過(guò)多，產(chǎn)生非特異擴(kuò)增，帶型彌散。5個(gè)TaqDNA聚合酶濃度梯度的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖4。濃度為2、2.5 U時(shí)條帶完整清晰，3 U時(shí)條帶彌散模糊，綜合考慮擴(kuò)增效果與成本，選用TaqDNA聚合酶濃度為2 U。

圖2　引物用量對(duì)番茄ISSR-PCR的影響

圖3　dNTP濃度對(duì)番茄ISSR-PCR的影響

圖4　TaqDNA聚合酶濃度對(duì)番茄ISSR的影響

2.5退火溫度的篩選

退火溫度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)結(jié)果影響很大，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的12個(gè)溫度梯度49.0、50.0、51.0、51.5、52.0、52.2、52.5、52.8、53.0、54.0、55.0、56.0℃篩選引物的最佳退火溫度（表1）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，每條引物有其獨(dú)特的退火溫度，23條引物中退火溫度最低的為49.0℃，最高的是55.0℃。各引物的最佳退火溫度與TM值之差大多在5℃之內(nèi)，引物874的最佳退火溫度與TM值之差達(dá)到9.7℃。

表1　23個(gè)差異引物的退火溫度

2.6體系的驗(yàn)證

引物868對(duì)38個(gè)番茄高代自交系在50 ng模板DNA，0.3 μmol/L引物，0.50 mmol/L dNTP，2.0 U TaqDNA聚合酶，2.0 mmol/L MgCl2，2.0 μL10 PCR緩沖液，加入滅菌的超純水至20 μL的體系，退火溫度50.0℃進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增（圖5），表明實(shí)驗(yàn)所建立的番茄ISSR-PCR的反應(yīng)體系擴(kuò)增效果良好。

圖5　引物868擴(kuò)增的ISSR譜帶圖

2.7番茄ISSR-PCR的反應(yīng)體系的確立

通過(guò)實(shí)驗(yàn)確立的番茄ISSR-PCR的20 μL反應(yīng)體系為：2.0 μL 10×PCR緩沖液，50 ng模板DNA， 0.3 μmol/L引物，0.50 mmol/L dNTP，2.0 U TaqDNA聚合酶，加入滅菌的超純水至20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，50℃，退火1 min，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。各引物退火溫度有所差異參照表1。

3　討論

在生物技術(shù)研究領(lǐng)域中，分子技術(shù)一直是研究的熱點(diǎn)。ISSR結(jié)合了SSR和RAPD的優(yōu)點(diǎn)，克服了RFLP與RAPD的不足，簡(jiǎn)單方便，可以檢測(cè)到更高的種間遺傳差異，穩(wěn)定性也較高[9-11]。但I(xiàn)SSR-PCR的擴(kuò)增效果受物種、反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序等的影響，不同作物最佳反應(yīng)體系差異較大。根據(jù)不同物種ISSR-PCR反應(yīng)最佳體系報(bào)道[25-28]，引物用量多在0.1～0.8 μmol/L，模板DNA在30～100 ng，dNTP 0.1～0.4 mmol/L，TaqDNA聚合酶0.5～1.5 U。本實(shí)驗(yàn)TaqDNA聚合酶用量較高,20 μL反應(yīng)體系中TaqDNA聚合酶濃度為2、2.5 U時(shí)條帶完整清晰,dNTP用量也較高，濃度為0.5、0.625 mmol/L條帶較為清晰，模板DNA、引物用量與大部分研究一致。

筆者研究表明，退火溫度是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素，且各引物的最佳退火溫度差異較大，23個(gè)引物的最佳退火溫度在49.0～55.0℃。ISSR標(biāo)記使用單引物，長(zhǎng)度15～22 bp，各引物TM值不同。林鄭和等[29]在建立茶樹(shù)ISSR-PCR反應(yīng)體系時(shí)發(fā)現(xiàn)，退火溫度在大于引物TM值2～3.0℃。何海旺等[30]研究馬鈴薯ISSRPCR反應(yīng)體系則認(rèn)為，不同引物對(duì)退火溫度的反應(yīng)規(guī)律不同，退火溫度較TM值有高有低，但基本都在5℃以?xún)?nèi)。筆者的結(jié)果與兩者的研究均有不同，退火溫度與TM值之差最大達(dá)到9℃以上。這可能研究物種與引物序列有關(guān)。

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Optimization and Verification of ISSR-PCR Reaction System for Lycopersicon esculentum

Li Yongping1,2,3,Kang Jianban1,2,3,Lin Hui1,2,3
(1Vegetable Centre,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013,Fujian,China;2Institute of Crop Sciences,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013,Fujian,China;3Engineering Research Center for Vegetable in Fujian,Fuzhou 350013,Fujian,China)

Abstract:To study the optimization of ISSR-PCR reaction system for Lycopersicon esculentum,the effects of five main factors(TaqDNA polymerase dosage,dNTP concentration,primer concentration,DNA templates concentration and annealing temperature of each primer)on ISSR amplification were investigated,to lay a foundation for ISSR technique in tomato molecular assisted breeding.The results showed that the optimal ISSR-PCR reaction system(20 μL)contained 50 ng DNA template,0.3 μmol/L primer,0.5 mmol/L dNTP,2 U TaqDNA polymerase,and 2.0 μL 10×PCR buffer.In addition,the optimal annealing temperature of each primer for ISSR-PCR reaction was different.

Key words:Lycopersicon esculentum;Genetic Relationship;Inter-simple Sequence Repeat;Optimization

收稿日期：2015-08-20，修回日期：2015-11-16。

通訊作者：康建坂，男，1976年出生，福建永春人，副研究員，碩士，研究方向：蔬菜育種。

作者簡(jiǎn)介：第一李永平，女，1974年出生，福建順昌人，碩士，研究方向：蔬菜育種。

通信地址：350003福建省福州市五四路247號(hào)福建省農(nóng)科院高新大樓1711，E-mail：248937256@qq.com。 350003福建省福州市五四路247號(hào)福建省農(nóng)科院高新大樓1711，E-mail：68787369@qq.com。

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目“利用SSR和SRAP標(biāo)記構(gòu)建辣椒遺傳圖譜”(2014J01115)；福建省農(nóng)業(yè)科技重大專(zhuān)項(xiàng)“茄果類(lèi)蔬菜新品種選育與種業(yè)產(chǎn)業(yè)化研究”(2013NZ0002-3)。

中圖分類(lèi)號(hào)：S795.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A論文編號(hào)：cjas15080012