蘆筍種質(zhì)資源的SRAP遺傳多樣性分析

李　霞，李書華，楊　林，于繼慶，李保華，鄭　鑫，包艷存（山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東濰坊261071）

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蘆筍種質(zhì)資源的SRAP遺傳多樣性分析

李霞，李書華，楊林，于繼慶，李保華，鄭鑫，包艷存
（山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東濰坊261071）

摘要：為了更深入地揭示蘆筍品種（系）的遺傳多樣性，本研究采用SRAP技術(shù)對國內(nèi)外12個蘆筍栽培種和雜交種的遺傳多態(tài)性進行分析。結(jié)果表明，從170對引物中篩選出29對多態(tài)性強、條帶清晰的引物，每對引物產(chǎn)生12～36條譜帶，共產(chǎn)生551條譜帶，其中多態(tài)性條帶343條，占總帶數(shù)的61.21%。平均每個引物擴增的DNA帶數(shù)是20.41條，多態(tài)性帶數(shù)是12.7條。采用NTSYSpc2.1軟件對SRAP擴增結(jié)果進行聚類分析，12份蘆筍材料的相似系數(shù)在0.39～0.97之間，平均相似系數(shù)為0.69。在Coefficient=0.69處劃等值線，可將12份蘆筍材料劃分為4類。第一類：‘魯蘆筍一號’、‘88-5’、‘格蘭德’、‘07-1’和‘06-6’。第二類：‘阿波羅’、‘澤西巨人’和‘阿特拉斯’。第三類：‘西班牙達瑪斯’。第四類：‘荷蘭全雄’、‘UC800’和‘西德全雄’。

關(guān)鍵詞：蘆筍；種質(zhì)資源；SRAP；遺傳多樣性

0　引言

相關(guān)序列擴增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)是一種新型的基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)，由美國加州大學(xué)蔬菜作物系Li與Quiros博士于2001年提出[1]。該技術(shù)與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比有明顯的優(yōu)越性，如實驗操作簡單、多態(tài)性高、在基因組中分布均勻、實驗結(jié)果穩(wěn)定、引物具有通用性等。近年來SRAP技術(shù)已被用于黃花蒿[2]、麻櫟[3]、甜瓜[4]、蔥[5]、桂花[6]等作物的遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系鑒定等方面。蘆筍(Asparagus officinalis L.)，又稱石刁柏，是百合科天門冬屬植物，該屬約有300種，除美洲外，全世界都有分布。核型分析表明該屬植物有二倍體、四倍體和六倍體，共同的染色體基數(shù)x＝10。目前，國內(nèi)外對蘆筍的研究多集中在同工酶[7-8]、繁殖栽培技術(shù)[9-10]、細(xì)胞學(xué)等方面的研究[11-12]，而關(guān)于分子水平的研究較少，李媛媛[13]對蘆筍性別連鎖分子標(biāo)記及蘆筍性別決定基因克隆的研究概況作了綜述。周勁松等[14]2007年，研究表明STS標(biāo)記Asp1-T7在雄性DNA池與雌性DNA池間具有多態(tài)性，可以用來對蘆筍雄性兩性株S1群體進行性別輔助選擇。周勁松等[15]2012年研究表明顯性標(biāo)記Asp-T7和Asp1-T7sp特異性好，擴增效果穩(wěn)定，均能夠鑒別蘆筍雌、雄性別；一共測驗了14株蘆筍兩性株自交后代S1代的雄株，從中篩選出2株超雄株。高武軍[16]利用RAPD技術(shù)對石刁柏雌雄株基因組差異進行了分析，發(fā)現(xiàn)了2條雌性相關(guān)的RAPD片斷，長度分別為928、1178 bp。蘇俊祥[17]利用RACE技術(shù)從石刁柏中分離了一個SUPERMAN類單鋅指蛋白的基因AoSUP，并對AoSUP的基因序列、蛋白結(jié)構(gòu)、雌雄株不同營養(yǎng)組織表達差異進行了初步分析。李霞等[18]以蘆筍(Asparagus officinalis L.)為材料，對影響SRAP-PCR擴增結(jié)果的因素dNTPs、Taq DNA酶、Mg2+、引物、模板DNA進行了正交優(yōu)化設(shè)計，確立了適合蘆筍SRAP-PCR分析的最佳反應(yīng)體系。尋找蘆筍種質(zhì)間遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析中適用的有效分子標(biāo)記技術(shù)，是目前蘆筍品種鑒定、遺傳關(guān)系分析及種質(zhì)資源評價工作中急需解決的問題。本研究就采用SRAP技術(shù)對12份蘆筍種質(zhì)資源進行多態(tài)性分析，在DNA水平上探索蘆筍種質(zhì)資源的遺傳距離，以便為蘆筍種質(zhì)資源的有效利用在分子水平上提供參考。

1　材料與方法

1.1供試材料

所有的試驗材料均來自于山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗基地，選取當(dāng)年萌發(fā)的幼嫩筍或葉片，洗凈、吸干水分，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩９?2份（表1）。

表1　供試12份蘆筍材料

1.2試驗方法

1.2.1基因組DNA提取采用改良的CTAB法[19]提取蘆筍DNA，產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測，選出符合試驗要求的DNA樣品，-20℃保存。

1.2.2 SRAP-PCR擴增擴增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35℃復(fù)性1 min，72℃延伸1.5 min，共5個循環(huán)；30 s后，94℃變性1 min，50℃復(fù)性1 min，72℃延伸1.5 min，共35個循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。1.2.3電泳檢測擴增反應(yīng)在美國ApolloATC-401擴增儀上完成。擴增產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳緩沖液為1×TBE，恒功率70 W，溴酚藍距離凝膠2～3 cm處結(jié)束電泳。電泳后銀染。蒸餾水沖洗后照相或者保存。

2　結(jié)果與分析

2.1基因組DNA的質(zhì)量檢測

將提取的12份基因組DNA用TE溶解后，1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察，照相。結(jié)果顯示，蘆筍基因組DNA帶型表現(xiàn)整齊、清晰（圖1）。

圖1　12份蘆筍基因組DNA電泳結(jié)果

2.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化

蘆筍SRAP-PCR反應(yīng)體系參照李霞[18]的正交優(yōu)化反應(yīng)體系。20 μL的反應(yīng)體積中包括0.2 mmol/LdNTPs 0.4 μL；1 U Taq DNA酶1.0 μL；1.5 mmol/L Mg2+1.2 μL；上下引物各30 ng，每個引物0.5 μL；60 ng模板DNA1.0μL；10×Buffer2.0μL；無菌雙蒸水13.4μL。

2.3引物組合篩選

所用引物均購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，上引物17個，下引物10個，隨機排列形成170對引物（表2）。

本試驗用優(yōu)化后的體系對所有170對引物組合進行擴增，所用材料為12份蘆筍材料。結(jié)果顯示，有29對組合均能擴增出多態(tài)性強、清晰度高的條帶帶（圖2）。

2.4蘆筍SRAP標(biāo)記遺傳多樣性分析

本試驗用篩選出29對引物對12份蘆筍材料進行重新擴增，結(jié)果顯示，擴增片段大小在100～1500 bp之間，每對引物組合產(chǎn)生12～36條譜帶，共產(chǎn)生551條譜帶，其中多態(tài)性條帶343條，占總帶數(shù)的61.21%。平均每對引物擴增的DNA帶數(shù)是20.41條，多態(tài)性帶數(shù)是12.7條（表3）。不同的引物組合擴增出的總帶數(shù)和多態(tài)性帶數(shù)的差異較大，產(chǎn)生帶數(shù)對多的引物組合是K1，擴增出36條帶；產(chǎn)生帶數(shù)最少的引物組合有2個，分別是E7、K10，擴增出12條帶。產(chǎn)生多態(tài)性最高的引物組合是K1，多態(tài)性百分率為86.11%；多態(tài)性較低的引物組合是C3，多態(tài)性百分率為42.86%。引物組合F6擴增的SRAP帶型（圖3）。

表2　SRAP隨機引物的序列

圖2　引物組合篩選擴增圖譜

2.5聚類分析

對12份蘆筍材料的SRAP擴增結(jié)果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，每個材料的擴增帶按有或無記錄，“有”附值為1，“無”賦值為0，從而得到原始數(shù)據(jù)矩陣。采用NTSYSpc 2.1軟件計算基因型間的Nei氏遺傳相似系數(shù)（表4）。UPGMA法聚類構(gòu)建樹狀圖（圖4）。由表4可以看出，12份蘆筍材料的相似系數(shù)在0.39～0.97之間，平均相似系數(shù)為0.69，遺傳多樣性相對偏低。

由圖4可知，在Coefficient=0.69處劃等值線，可將12份蘆筍材料劃分為4類。第一類：‘魯蘆筍一號’、‘88-5’、‘格蘭德’、‘07-1’和‘06-6’。第二類：‘阿波羅’、‘澤西巨人’、‘阿特拉斯’。第三類：‘西班牙大瑪斯’。第四類：‘荷蘭全雄’、‘UC800’和‘西德全雄’。

表3　29個引物組合產(chǎn)生的多態(tài)性條帶數(shù)

圖3　引物組合F6的擴增產(chǎn)物

從聚類圖上可以看出，各品種的地理來源同聚類結(jié)果有一定關(guān)系。如來源于中國的‘魯蘆筍一號’和‘88-5’改良系（濰坊市農(nóng)科院自培品種）、來自美國的‘格蘭德’和‘07-1’，相似系數(shù)均高達0.97；在第一類中‘07-1’和‘06-6’均來自于美國，相似系數(shù)為0.94。美國培育的‘澤西巨人’和‘阿特拉斯’（相似系數(shù)為0.81）聚為一小類后，又和‘阿波羅’聚為一類（相似系數(shù)為0.77）。在相似系數(shù)為0.69水平上‘西班牙大瑪斯’單獨聚為一類。從圖中還可以看出不同的地理來源，但同為全雄品種也聚為一類，如‘荷蘭全雄’、‘UC800’和‘西德全雄’聚為一類，相似系數(shù)為0.81～0.90，平均相似系數(shù)為0.85。

3　結(jié)論與討論

SRAP分子標(biāo)記技術(shù)不僅多態(tài)性高、重復(fù)性好、操作簡單、在基因組中分布均勻、引物具有通用性，而且其正向引物可以與反向引物兩兩搭配組合，因此用少量的引物可組配得到多個引物組合，提高了引物的使用效率，降低合成引物成本。因而利用SRAP構(gòu)建品種指紋圖譜是一種經(jīng)濟實用的方法。本研究采用SRAP技術(shù)對國內(nèi)外12個蘆筍栽培種和雜交種的遺傳多態(tài)性進行分析。從170對引物中篩選出29對多態(tài)性強、條帶清晰的引物，每對引物產(chǎn)生12～36條譜帶，共產(chǎn)生551條譜帶，其中多態(tài)性條帶343條，占總帶數(shù)的61.21%。平均每個引物擴增的DNA帶數(shù)是20.41條，多態(tài)性帶數(shù)是12.7條。采用NTSYSpc2.1軟件對SRAP擴增結(jié)果進行聚類分析，12份蘆筍材料的相似系數(shù)在0.39～0.97之間，平均相似系數(shù)為0.69。在Coefficient=0.69處劃等值線，可將12份蘆筍材料劃分為4類。第一類：‘魯蘆筍一號’、‘88-5’、‘格蘭德’、‘07-1’和‘06-6’。第二類：‘阿波羅’、‘澤西巨人’和‘阿特拉斯’。第三類：‘西班牙達瑪斯’。第四類：‘荷蘭全雄’、‘UC800’和‘西德全雄’。試驗結(jié)果與李可峰[20]的比較吻合，說明蘆筍總體上差異不大，特別是遺傳基礎(chǔ)在逐漸變窄，與本研究結(jié)果相同。

為此，中國蘆筍育種除了作好現(xiàn)有優(yōu)良品種的保藏和選育外，還應(yīng)做好以下4方面工作：（1）繼續(xù)選育自有優(yōu)良品種。目前專門從事蘆筍育種研究的有江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、北京市農(nóng)林科學(xué)院等，育成的品種有15個，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)進行蘆筍自有優(yōu)良品種的選育完全有可能實現(xiàn)。（2）加大兩性株的應(yīng)用。蘆筍雌雄異株，在自然情況下，蘆筍雄株和雌株的株數(shù)大體各占一半。蘆筍性別是由一對獨立基因控制的，蘆筍雄性兩性株的遺傳規(guī)律不同于雌、雄株。它們同株可以自交，其自交后代75%為雄株（1/3為同質(zhì)雄株，2/3為異質(zhì)雄株），25%為雌株。在整個自交選擇中，可以篩選出超雄株，繼而快速選育出全雄品種，蘆筍產(chǎn)量大幅度提升。（3）優(yōu)良品種與野生近緣種雜交。選育出具有野生近緣種抗病性強、耐貧瘠、抗風(fēng)沙等的品種。（4）加大對外合作力度，廣泛搜集國外具有優(yōu)良性狀的品種，拓寬親本選擇范圍，徹底改變中國蘆筍育成品種遺傳基礎(chǔ)狹窄的局面。

表4　12份蘆筍品種的Nei氏相似系數(shù)矩陣

圖4　基于SRAP標(biāo)記的12份蘆筍材料聚類圖

參考文獻

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Genetic Diversity Analysis of Asparagus Based on SRAP Markers

Li Xia,Li Shuhua,Yang Lin,Yu Jiqing,Li Baohua,Zheng Xin,Bao Yancun
(Weifang Academy of Agricultural Sciences,Weifang 261071,Shandong,China)

Abstract:This paper analyzed the genetic polymorphism of 12 asparagus cultivars and hybrids from home and abroad using SRAP method,so as to deeply reveal the genetic diversity of asparagus varieties.The results showed that 29 primers with high polymorphism and clear bands were screened from 170 primers,each of them amplified 12 to 36 bands and a total of 551 DNA fragments were obtained,343 bands showed polymorphism in all fragments,accounted for 61.21%.The average number of DNA bands produced by each primer was 20.41 and polymorphic bands were 12.7.The result of genetic similarity analysis of 12 asparagus genotypes showed that the Nei’s coefficient ranged from 0.39 to 0.97,and the average Nei’s coefficient was 0.69.A DNA molecular dendrogram was established for 12 genotypes which were divided into 4 groups according to the coefficient of 0.69.The first group included‘Lu Asparagus No.1’,‘88-5’,‘Gland’,‘07-1’and‘06-6’. The second group included‘Apollo’,‘Jersey Giant’and‘Atlas’.The third group included‘Spanish Damas’. The forth group included‘Holland all male’and‘West Germany all male’.

Key words:Asparagus officinalis L.;Germplasm;SRAP;Genetic Diversity

收稿日期：2015-10-15，修回日期：2015-12-16。

通訊作者：楊林，男，1980年出生，山東煙臺人，農(nóng)藝師，推廣碩士，主要從事蘆筍栽培研究。

作者簡介：第一李霞，女，1976年出生，山東萊蕪人，副研究員，碩士，主要從事蘆筍遺傳育種的研究。

通信地址：261071山東省濰坊市勝利東街1921號山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，Tel：0536-2118589，E-mail：55654687@qq.com。 261071山東省濰坊市勝利東街1921號山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，Tel：0536-2118589，E-mail：80408239@qq.com。

基金項目：山東省科技發(fā)展計劃專項計劃項目“蘆筍超雄株技術(shù)研究與示范”(2012GZX21024)。

中圖分類號：S644.6

文獻標(biāo)志碼：A論文編號：cjas15100011