應(yīng)用神經(jīng)突方向分散度和密度成像技術(shù)研究rs747302基因單核苷酸多態(tài)性對(duì)青春期兒童腦白質(zhì)微結(jié)構(gòu)的影響

李霄揚(yáng)，黃明珠，張旭，于兵

作者單位：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院放射科，沈陽(yáng)，110001

近年來的一系列研究發(fā)現(xiàn)，多巴胺受體D4基因啟動(dòng)子區(qū)-616 位點(diǎn)(rs747302)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)可能與多種兒童精神異常，如注意缺陷多動(dòng)障礙，原發(fā)性夜間遺尿癥[1-2]等的發(fā)病具有相關(guān)性，但是rs747302基因多態(tài)性對(duì)正常青春期兒童腦微結(jié)構(gòu)，特別是白質(zhì)微結(jié)構(gòu)的研究，截至目前未見相關(guān)報(bào)道。

擴(kuò)散磁共振成像技術(shù)通過施加不同參數(shù)的梯度脈沖，以測(cè)量微米數(shù)量級(jí)的水分子擴(kuò)散差異，從而計(jì)算出細(xì)胞完整性和組織微結(jié)構(gòu)等信息，是目前唯一有能力在活體無創(chuàng)地檢測(cè)腦白質(zhì)微結(jié)構(gòu)的影像學(xué)手段。擴(kuò)散張量成像是目前最經(jīng)典且臨床應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，它對(duì)于腦白質(zhì)微組織結(jié)構(gòu)異常具有較好的敏感性，但是特異性不夠強(qiáng)，腦白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的某些特性有時(shí)會(huì)被掩蓋，例如，擴(kuò)散張量成像反映的微結(jié)構(gòu)的各向異性差異往往被方向分散所掩蓋。只有區(qū)分出這些特性，才能夠?qū)渫缓洼S突的微結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的無創(chuàng)性的探索。

Zhang等[3]基于磁共振擴(kuò)散成像掃描開發(fā)的神經(jīng)突方向分散度和密度成像(neurite orientation dispersionand density imaging，NODDI)技術(shù)，為臨床實(shí)現(xiàn)神經(jīng)突(樹突和軸突)的微結(jié)構(gòu)檢測(cè)提供了全新的渠道。因而，本研究計(jì)劃使用NODDI技術(shù)，探索rs747302基因?qū)φＧ啻浩趦和X白質(zhì)微結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究根據(jù)rs747302基因型檢測(cè)結(jié)果以及患者的性別、年齡狀況，在2016年1月至2018年12月期間，選取182名年齡11～13歲，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育正常的青春期兒童。該研究計(jì)劃已經(jīng)獲得我院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)2015PS54)，所有參與研究的被試者本人及其父母(父母不具備民事行為能力時(shí)由其法定監(jiān)護(hù)人代理)均簽署了相應(yīng)的知情同意書。

所有參與研究的青春期兒童入組標(biāo)準(zhǔn)如下：神經(jīng)和精神系統(tǒng)問診及查體正常，無血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及精神疾病病史；常規(guī)MRI檢查腦實(shí)質(zhì)未見異常；無睡眠呼吸異常病史；無典型精神及精神藥物服用史，由具備資質(zhì)的心理科醫(yī)師進(jìn)行韋氏智力測(cè)驗(yàn)后確認(rèn)智商(intelligence quotient，IQ)＞8。

1.2 數(shù)據(jù)采集

1.2.1 rs747302基因型分析

所有受試兒童常規(guī)采集5 ml外周靜脈血，并采用EDTA抗凝，用碘化鉀法從外周血淋巴細(xì)胞中提取基因組DNA用于后續(xù)檢測(cè)。rs747302 SNP分析采用PCR技術(shù)，使用 ABI 9700 PCR擴(kuò)增儀檢測(cè)rs747302基因C/G多態(tài)性，PCR反應(yīng)的引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)條件詳見表1。由于人群中rs747302基因的CC純合子分布頻率很低，因而本研究中將CC和CG基因型的被試合并為C等位基因攜帶組(C組)，與G純合子被試兒童(G組)進(jìn)行組間對(duì)比。

1.2.2 韋氏智力測(cè)驗(yàn)

韋氏智力測(cè)驗(yàn)采用湖南醫(yī)科大學(xué)龔耀先等修訂的韋氏兒童智力量表(C-WISC)[4]。所有受試者均完成11項(xiàng)分測(cè)驗(yàn)，其中言語(yǔ)分測(cè)驗(yàn)6項(xiàng)包括知識(shí)(I)、領(lǐng)悟(C)、分類(S)、算術(shù)(A)、數(shù)字廣度(D)、詞匯(V)；操作分測(cè)驗(yàn)5項(xiàng)包括填圖(PC)、圖片排列(PA)、木塊圖(BD)、圖形拼湊(OA)、編碼(Cd)。從分測(cè)驗(yàn)中分別獲得言語(yǔ)量表分(V)、操作量表分(P)及總量表分(F)。進(jìn)一步計(jì)算言語(yǔ)智商(VIQ)、操作智商(PIQ)、總智商(IQ)，3個(gè)因子智商：言語(yǔ)理解因子(VC)=I+V+C+S、知覺組織因子(PO)=PC+PA+BD+OA、記憶/不分心因子(M/C)=A+D+Cd。

1.2.3 磁共振掃描數(shù)據(jù)處理

NODDI掃描采用Philips Ingenia 3.0 T超導(dǎo)型MRI掃描儀，使用64通道頭線圈進(jìn)行掃描。NODDI 掃描采用多層同時(shí)成像(Multi-Band SENSE)自旋平面回波(SEEPI)序列，掃描參數(shù)：TR 4000 ms，TE 85 ms，反轉(zhuǎn)角90°，SENSE加速因子為P=2.5，Multi-Band加速因子為2，F(xiàn)OV 220 mm×220 mm，掃描矩陣110，層厚2 mm，層間距0 mm，層數(shù)54層，b值為0、1000 s/mm2及2000 s/mm2，每個(gè)b值下擴(kuò)散敏感梯度方向32個(gè)。NODDI序列掃描時(shí)間為7 min。

從MRI掃描儀導(dǎo)出NODDI掃描的原始圖像，在由專業(yè)的神經(jīng)組放射科醫(yī)師目視觀察去除形變和頭動(dòng)明顯的被試數(shù)據(jù)后，首先應(yīng)用FSL (https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/)軟件包對(duì)NODDI數(shù)據(jù)進(jìn)行渦流頭動(dòng)校正和剝腦預(yù)處理，然后應(yīng)用倫敦大學(xué)Hui Zhang教授團(tuán)隊(duì)編寫，的NODDI Matlab Toolbox (V0.9)(http://mig.cs.ucl.ac.uk/index.php?n=Download.NODDI)軟件包，計(jì)算得到突觸體積分?jǐn)?shù)(neurite density index，NDI)、神經(jīng)突方向分散系數(shù)(orientation dispersion index，ODI)等NODDI指標(biāo)圖。

為進(jìn)一步計(jì)算白質(zhì)NODDI指標(biāo)的組間差異，本研究采用FSL基于纖維束示蹤的空間統(tǒng)計(jì)分析(Tract-Based Spatial Statistics，TBSS)組件，對(duì)NODDI指標(biāo)圖(NDI和ODI圖)進(jìn)行深入分析，具體步驟如下：首先應(yīng)用FSL DTIFIT組件，根據(jù)預(yù)處理后的NODDI數(shù)據(jù)中的b=700s/mm2，32個(gè)彌散梯度方向的掃描數(shù)據(jù)，計(jì)算每名被試的部分各向異性圖；然后應(yīng)用FMRIB Non-linear Registration Tool工具包，將各向異性圖配準(zhǔn)到蒙特利爾神經(jīng)研究所(Montreal neurological institute，MNI)空間；之后應(yīng)用TBSS軟件包根據(jù)配準(zhǔn)后的部分各向異性圖得到平均部分各向異性圖纖維骨架圖像；最后，將所有被試的NODDI指標(biāo)圖(NDI和ODI圖)映射到平均部分各向異性圖纖維骨架上，得到每個(gè)被試的ODI纖維骨架圖和ODI纖維骨架圖。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件包(SPSS Inc.，Chicago，IL，U S A)對(duì)被試數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。首先采用Kolmogorov–Smirnov檢驗(yàn)對(duì)于所有的定量數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)則以中位數(shù)(四分位間距)表示。采用Student’st檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)對(duì)于年齡、受教育程度進(jìn)行各組間比較，采用Chi-square檢驗(yàn)比較性別的各組間差異，以P＜0.05作為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

由于韋氏智力測(cè)驗(yàn)的部分結(jié)果為非正態(tài)分布，所以我們采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)對(duì)智力測(cè)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行組間比較，并采用Bonferroni法進(jìn)行多重比較校正，以校正后P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

為了探索不同基因型被試白質(zhì)微結(jié)構(gòu)的組間差異，本研究應(yīng)用FSL的Randomize組件，將性別、年齡受教育程度和IQ作為協(xié)變量，采用置換檢驗(yàn)(置換次數(shù)5000次)分別對(duì)于NDI和ODI的纖維骨架圖進(jìn)行基于纖維束示蹤的組間分析，組間分析結(jié)果采用參考簇水平(threshold-free cluster enhancement，TFCE)方式進(jìn)行多重比較校正，將校正后P＜0.05的白質(zhì)區(qū)域作為組間差異顯著。根據(jù)約翰霍普金斯大學(xué)ICBM-DTI-81白質(zhì)纖維圖譜定位組間差異顯著的白質(zhì)纖維束。

表1 rs747302基因型分析引物及反應(yīng)條件Tab. 1 Protocol of rs747302 genotyping

表2 所有被試DRD4 -616位點(diǎn)基因檢測(cè)結(jié)果Tab. 2 The results of genotyping of DRD4 -616 C/G SNP

表3 所有被試基本情況Tab. 3 Demographic data of the participants

為了深入分析NODDI指標(biāo)的組間比較結(jié)果，我們分別將NDI和ODI組間差異顯著的白質(zhì)區(qū)域作為感興趣區(qū)，提取所有被試感興趣區(qū)內(nèi)的NODDI指標(biāo)進(jìn)行組間比較，并且采用Spearman相關(guān)分析的方法，探索感興趣區(qū)內(nèi)NODDI指標(biāo)與韋氏智力測(cè)驗(yàn)的相關(guān)性。

2 結(jié)果

4名被試兒童的NODDI影像數(shù)據(jù)形變或頭動(dòng)明顯，其基因型數(shù)據(jù)和影像數(shù)據(jù)被排除。列入統(tǒng)計(jì)的被試基因檢測(cè)結(jié)果見表2，他們的年齡和接受教育時(shí)間未見組間差異，但是C等位基因攜帶者的記憶/不分心因子顯著低于G純合組，詳見表3、4。

基于TBSS組間分析結(jié)果顯示，rs747302基因C/G SNP導(dǎo)致的被試白質(zhì)組間差異主要位于雙側(cè)丘腦前輻射(anterior thalamic radiation，ATR)，表現(xiàn)為ODI的升高及NDI的減低(P＜0.05，TFCEcorrected)(圖1)。分別將NDI和ODI組間差異顯著的ATR白質(zhì)區(qū)域作為感興趣區(qū)，提取所有被試感興趣區(qū)內(nèi)的NODDI指標(biāo)進(jìn)行組間比較，發(fā)現(xiàn)C等位基因攜帶者的ATR的ODI值顯著高于G純合組，而且NDI顯著低于G純合組(U=120，P＜0.001；U=890，P＜0.001)。Spearman相關(guān)分析的結(jié)果顯示，C等位基因攜帶者的NDI值與記憶/不分心因子正相關(guān)(r=0.6804，P＜0.001) (圖2)。

表4 韋氏智力測(cè)驗(yàn)結(jié)果Tab. 4 Intelligence testing results of the participants

圖1 rs747302基因多態(tài)性對(duì)白質(zhì)NODDI參數(shù)的影響 圖2 rs747302對(duì)ATR NODDI參數(shù)的影響極其與注意/不分心因子的聯(lián)系 Fig. 1 Effect of rs747302 gene on NODDI parameters of white matter. Fig. 2 Effect of rs747302 gene on NODDI parameters of ATR and its relationship with M/C factor.

基于纖維束示蹤的組間分析結(jié)果顯示，rs747302基因C/G SNP導(dǎo)致的被試白質(zhì)組間差異主要位于雙側(cè)丘腦前輻射(anterior thalamic radiation，ATR)，表現(xiàn)為ODI的升高及NDI的減低。

組間分析結(jié)果顯示：(A) C等位基因攜帶者ATR的NDI值顯著低于G純合組；(B) C等位基因攜帶者ATR ODI顯著高于G純合組；(C) C等位基因攜帶者記憶/不分心因子顯著低于G純合組；(D) C等位基因攜帶者的NDI值與記憶/不分心因子正相關(guān)(r=0.6804；P＜0.001)。

3 討論

NODDI建立了一個(gè)可以區(qū)分細(xì)胞內(nèi)間隔、細(xì)胞外間隔和腦脊液等三種微結(jié)構(gòu)環(huán)境的組織結(jié)構(gòu)模型：細(xì)胞內(nèi)間隔指神經(jīng)突膜環(huán)繞的空間。在腦組織內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)間隔模擬的神經(jīng)方向的范圍包括方向高度一致的白質(zhì)結(jié)構(gòu)(如胼胝體)、彎曲或者呈輻射狀的白質(zhì)結(jié)構(gòu)(如半卵圓中心)和向各個(gè)方向蔓延為特征的皮層和皮層下灰質(zhì)結(jié)構(gòu)；細(xì)胞外間隔)細(xì)胞外間隔是指神經(jīng)周圍的空間，它被各種類型膠質(zhì)細(xì)胞和灰質(zhì)中的細(xì)胞體所占據(jù)。在這個(gè)空間里，水分子的擴(kuò)散被神經(jīng)突起所阻礙，而不是僅僅受限。因此，用簡(jiǎn)單的各向異性擴(kuò)散模擬細(xì)胞外間隔。CSF(腦脊液)是指腦脊液所占據(jù)的空間。這個(gè)空間用各向同性的符合高斯分布的擴(kuò)散來描述?，F(xiàn)有的研究表明，相對(duì)于傳統(tǒng)的擴(kuò)散張量成像模型，NODDI模型于白質(zhì)的微結(jié)構(gòu)有著更高的靈敏性和特異性[5]。

rs747302基因位于DRD4基因啟動(dòng)子區(qū), 存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白AP-2的結(jié)合位點(diǎn)，而該位點(diǎn)C、G等位基因的多態(tài)性[6]，可能影響AP22結(jié)合位點(diǎn)的活性,從而影響了DRD4基因的誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而造成一些DRD4蛋白結(jié)構(gòu)與功能的變化[4，7]。

本研究結(jié)果顯示，rs747302基因主要造成了雙側(cè)ATR的白質(zhì)微結(jié)構(gòu)改變,而且ATR的NDI改變與C等位基因攜帶者的注意/不分心因子相關(guān)。ATR結(jié)構(gòu)主要連接丘腦以及額葉，是額葉-丘腦神經(jīng)環(huán)路的重要聯(lián)絡(luò)纖維，而額葉-丘腦神經(jīng)環(huán)路對(duì)于注意力的維持、睡眠/覺醒狀態(tài)的切換以及排尿行為的控制都起著重要的作用[8]?？紤]已有研究證實(shí)ADHD和遺尿癥的額葉-丘腦結(jié)構(gòu)連接及功能連接均存在異常[9-11]，筆者推測(cè)C等位基因攜帶者的ATR微結(jié)構(gòu)改變可能造成了他們ADHD和遺尿癥發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)升高；考慮到ATR的NDI改變與C等位基因攜帶者的注意/不分心因子減低具有相關(guān)性，可能表明rs747302基因的多態(tài)性，與ADHD患者的注意力不集中以及以前研究中發(fā)現(xiàn)的PNE患兒注意缺陷可能存在一定的關(guān)聯(lián)性[12]。

本研究還表明C等位基因攜帶者的ATR ODI值升高且NDI減低，這表明C等位基因攜帶者的ATR部分區(qū)域神經(jīng)突總體積減小，而且神經(jīng)突的排列比較分散。基于以往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，筆者推測(cè)rs747302基因的C等位基因影響了DRD4蛋白的表達(dá)，從而干擾了腦發(fā)育過程中突觸連接修剪的過程，進(jìn)而影響了C等位基因攜帶者ATR白質(zhì)的神經(jīng)突微結(jié)構(gòu)，造成了他們ATR的部分區(qū)域白質(zhì)神經(jīng)突減少，由于ATR神經(jīng)突的總體積減小，所以這些神經(jīng)突在相對(duì)大的空間內(nèi)可能分布排列也較G組分散[6]。

本研究還存在較多局限性，首先，因?yàn)闃颖玖考癈等位基因比率所限，我們?cè)谘芯恐袑?duì)CC和CG基因型的合并可能造成一定程度的遺傳效應(yīng)混淆；其次，考慮到青春期兒童的生長(zhǎng)發(fā)育變化比較劇烈，我們將被試的年齡限制在較小的范圍內(nèi)，因此我們還需要在以后對(duì)更大年齡范圍內(nèi)進(jìn)行深入研究和長(zhǎng)期隨訪，以驗(yàn)證rs747302基因SNP對(duì)于不同生長(zhǎng)發(fā)育階段兒童腦白質(zhì)微結(jié)構(gòu)的影響。

利益沖突：無。