高效液相色譜法測定飼料中甲酸鈣、雙乙酸鈉和丙酸鹽

段培姿 曹薇

摘 要：甲酸鈣、雙乙酸鈉和丙酸鹽是飼料中3種最常用的酸化劑。這些酸化劑可提高飼料酸度，還具有防腐、防霉的作用。目前，國家已依法將其納入規(guī)范化管理。因此，研究飼料中甲酸鈣、雙乙酸鈉和丙酸鹽的測定方法極其重要。

關(guān)鍵詞：酸化劑;飼料;甲酸鈣;雙乙酸鈉;丙酸鹽

1? ? 飼料中酸化劑添加存在的問題

甲酸鈣、雙乙酸鈉和丙酸鹽作為飼料添加劑，食用時存在以下問題：（1）添加酸量大則大大增加了成本，而且不能做預(yù)混料的材料。（2）添加的酸量少，則與飼料中堿性物質(zhì)、膽汁中和，無法保存。（3）添加酸量少的話也容易與飼料中的維生素、礦物元素反應(yīng)，無法保存。（4）添加酸過多的飼料，在胃中吸收過快，會對胃造成損傷。（5）添加酸量少，飼料到不了小腸，就不能起到調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。（6）易受潮、結(jié)塊，影響飼料的品質(zhì)。（7）添加量過多，會腐蝕飼料加工設(shè)備、倉儲設(shè)備、運輸車輛。因此，針對酸化劑的這些問題，準確檢測出酸化劑的質(zhì)量分數(shù)，找到最適合的添加量非常必要，可以幫助企業(yè)節(jié)約成本，實現(xiàn)固定資產(chǎn)的保值，還可以找到最適合的飼料配方，提升飼料的口感和品質(zhì)，提高企業(yè)的效益。

2? ? 飼料中酸化劑測定方法

目前，針對飼料中酸化劑的測定方法只有《飼料中丙酸、丙酸鹽的測定》（GB/T? 17815—2018），該方法的原理是：試樣中丙酸、丙酸鹽經(jīng)酸化后，丙酸鹽轉(zhuǎn)化成丙酸，經(jīng)過蒸餾將丙酸與基質(zhì)分離，餾出液中的丙酸再通過氣相色譜儀氫火焰離子化檢測器或者液相色譜儀紫外檢測器檢測，用外標法定量。與國標方法相比，本方法在以下4個方面存在不同。

（1）甲酸鈣、雙乙酸鈉和丙酸鹽都是兩種或者兩種以上同時添加至飼料中，該方法可一次檢測出，節(jié)約了檢測成本，節(jié)省了檢測時間，提高了檢測效益。（2）運用高效液相色譜法測定飼料中的雙乙酸鈉、甲酸鈣和丙酸鹽，得到了很好的響應(yīng)值和靈敏度，準確度和精密度都很高，可以用作實驗室內(nèi)部指控、初篩。（3）本研究針對甲酸、乙酸、丙酸易溶于水且成分比較簡單的特性，提取液不需要進一步凈化，經(jīng)濾膜過濾后上機測定。本方法除了采用蒸餾法提取外，還采用了經(jīng)超聲波水浴提取，這樣提取效率提高，簡化了提取設(shè)備和流程，也得到了很好的回收率和準確性。（4）本方法簡便快速、重現(xiàn)性好、靈敏度高、分離效果良好、檢測結(jié)果可信度高，作為飼料中甲酸鈣、雙乙酸鈉和丙酸鹽的測定方法，與國際標準方法相比回收率滿足要求。

本研究介紹的方法適用于飼料中甲酸鈣、雙乙酸鈉、丙酸鹽的測定。試樣中甲酸鈣、雙乙酸鈉、丙酸鹽易溶于水，經(jīng)磷酸酸化后轉(zhuǎn)化為甲酸、乙酸、丙酸，再利用蒸餾法或直接提取法提取，在高效液相色譜儀上進行分析。

3? ? 實驗過程與結(jié)果

3.1? 樣品提取條件

通過不斷的優(yōu)化、選擇，最終確定了蒸餾法和直接浸提法的最優(yōu)條件。蒸餾法：用感量為0.1 mg的分析天平準確稱取25 g試樣，置于500 mL蒸餾瓶中，加100 mL水，再用50 mL水沖洗容器，轉(zhuǎn)移到蒸餾瓶中，加磷酸溶液（1 mol/L）20 mL，2～3滴硅油，進行水蒸氣蒸餾，將250 mL容量瓶置于冰浴中作為吸收接收裝置，待蒸約240 mL時取出，在室溫下放置30 min，用1 mol/L磷酸溶液調(diào)pH為3左右，加水定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm水相微孔濾膜過濾后，用液相色譜測定。直接浸提法：用感量為0.1 mg的分析天平準確稱取5 g試樣至100 mL燒杯中，加水20 mL，加11 mol/L磷酸溶液0.5 mL，混勻，經(jīng)超聲浸提30 min后，用磷酸溶液（1 mol/L）調(diào)pH至3左右，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。將試樣全部轉(zhuǎn)移至50 mL具塞塑料管中，以不低于4 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm水相微孔濾膜過濾后，用液相色譜測定。兩種方法都能得到很好的回收率，保證了檢測結(jié)果的準確性。

3.2? 檢測波長的選擇

處理好的試樣經(jīng)高效液相色譜儀，分別對雙乙酸鈉、甲酸鈣、丙酸鹽進行光譜掃描，在190～400 nm 檢測波長范圍內(nèi)，觀察、比較3種物質(zhì)的紫外譜圖，可以得到甲酸鈣、雙乙酸鈉、丙酸鹽的最大吸收波長分別為210、192、194 nm。因為當最大吸收波長為192、194 nm時，不在遠紫外區(qū)，雙乙酸鈉和丙酸鹽均不容易檢測到，所以本實驗采取了國標（GB/T 23383—2009）方法中的波長進行加標回收試驗，通過試驗數(shù)據(jù)比較和分析重復(fù)測量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙乙酸鈉、丙酸鈣在檢測波長為210 nm時，結(jié)果的準確性和重復(fù)性均滿足要求。因此，把3種酸的最大吸收波長均定位為210 nm。

3.3? 流動相的選擇

甲酸鈣、雙乙酸鈉、丙酸鹽這3種有機酸均為弱酸，容易在水系流動相中發(fā)生解離，而不被非極性鍵合相保留，一般情況下，采用酸性磷酸氫鹽溶液抑制有機酸的解離，改善有機酸的保留時間和分離。綜合文獻資料，酸的存在形式和穩(wěn)定性受磷酸鹽緩沖液質(zhì)量濃度影響較大，分離效果非常明顯。磷酸鹽緩沖液質(zhì)量濃度、pH、溫度對有機酸的分離影響較大，通過排列組合的方法，在不同的磷酸鹽緩沖液質(zhì)量濃度、pH、柱溫條件下，加標回收測量3種物質(zhì)的量，通過比較，最終確定磷酸鹽緩沖液質(zhì)量濃度、pH、溫度分別為1 mol/L、2.5、40 ℃為最佳的分離條件。

3.4? 標準的重復(fù)性和精密度的確定

配置質(zhì)量濃度為10～500 μg/mL的甲酸、乙酸、丙酸混合標準溶液，用上述的方法進行檢測，以標準溶液的質(zhì)量濃度作橫軸、峰面積作縱軸畫標準曲線?？梢娝鶞y量的3種有機酸標準溶液在10～500 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系非常好。所研究的方法和設(shè)定的條件，將標準溶液連續(xù)稀釋后進行空白樣品的加標回收，根據(jù)10倍噪音求出峰響應(yīng)值，再通過計算取樣量和進樣量，得出方法的定量限，具體結(jié)果如表1所示。

表1? 有機酸線性關(guān)系

項目 線性方程 相關(guān)系數(shù)R 定量限/%

甲酸 Y=153 139x+0 0.999 4 0.05

乙酸 Y=40 553.5x+0 0.999 8 0.05

丙酸 Y=100 651x+0 0.999 9 0.05

應(yīng)用建立的方法，對從市場上獲得已知質(zhì)量分數(shù)的飼料酸化劑進行測定，檢測結(jié)果如表2所示。

結(jié)果表明：采用高效液相色譜法可同時檢測分析飼料中甲酸鈣、雙乙酸鈉和丙酸鹽的化學測質(zhì)量分數(shù)，具有簡便、快速、成本低、能使各組分較好地分離等特點，并表現(xiàn)出較高的準確性和精確度。其測試成本低、準確度高、精密度好，有很好的推廣價值。