豬流行性腹瀉病毒檢測與S蛋白中和抗原表位基因分析

丁衛(wèi)星，王榮談，郭佳宏，廖學(xué)文，繆德年*

（1上海瑞豐農(nóng)業(yè)科技有限公司，上海201106；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106）

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豬流行性腹瀉病毒檢測與S蛋白中和抗原表位基因分析

丁衛(wèi)星1，王榮談1，郭佳宏2，廖學(xué)文2，繆德年2*

（1上海瑞豐農(nóng)業(yè)科技有限公司，上海201106；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106）

摘 要：應(yīng)用RT-PCR對2015年江蘇、安徽、山東9個豬場的腹瀉樣品（新鮮糞便、腸道組織等）進行PEDV 和TGV檢測，并對檢測到的一株P(guān)EDV（CHNJPK2015）的纖突蛋白中和抗原表位基因進行克隆測序和遺傳進化分析。結(jié)果表明：9個豬場PEDV檢測陽性率為100％，PEDV個體陽性率為63" 89％，TGEV均未檢出，說明本次流行的仔豬腹瀉病主要是由PEDV感染引起的。所測毒株與參考毒株可分為3個群，CHNJPK2015株與AVCT12、Br1/87、CHM2013、LZC、SM98等毒株的S蛋白中和抗原表位基因的遺傳距離較近，核苷酸序列同源性達99" 5％—99" 8％，處于同一群；而與2014年中國各地分離的CH/GDZQ/2014、FJ-FQ 2014、FJ-ZP 2014、PEDV-LY、PEDV-WS、PZ1406、SC1402、SH1404和疫苗株CV777序列的遺傳距離較遠(yuǎn)，核苷酸序列同源性為92" 9％—96" 2％，處于不同的群。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；S蛋白；進化樹

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是一種由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的，以嚴(yán)重的腸炎、腹瀉、嘔吐、脫水和仔豬高死亡率為顯著特征的豬急性高度接觸性腸道傳染病。自2010年底我國豬流行性腹瀉疫情暴發(fā)以來，該病持續(xù)在我國流行蔓延，給養(yǎng)豬生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。2013年，PED首次傳入美國和墨西哥，2014年擴散到加拿大、多米尼加，引起了全球的廣泛關(guān)注和重視［1］。PEDV為單股正鏈RNA病毒，基因組全長為30 000 bp左右，編碼纖突蛋白（spike protein，S）、小包膜蛋白（envelope，E）、膜糖蛋白（membrane，M）和核衣殼蛋白（nucleocapsid，N）等4種主要結(jié)構(gòu)蛋白，其中S蛋白位于病毒粒子的外表面，在病毒侵入宿主細(xì)胞和誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的過程中發(fā)揮重要作用［2］。PEDV的主要中和抗原位于S基因的1 495—1 914 bp［3］。PEDV常與豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）混合感染，且這兩種病毒引起的臨床癥狀和病理變化非常相似，給臨床診斷和防治增加了難度。本研究對2015年江蘇、安徽、山東9個臨床癥狀表現(xiàn)腹瀉的豬場進行了PEDV 和TGEV的檢測，并對一個分離毒株的遺傳變異進行分析，以期為該病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

小腸及糞便樣品于2015年1—4月采自江蘇、安徽、山東9個發(fā)病豬場具有腹瀉臨床癥狀的仔豬。

大腸桿菌（Escherichia coli）JM109感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T載體、RNA提取試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DL2000 DNA Marker、質(zhì)粒小量提取試劑盒均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1．2 引物

參考文獻［4］設(shè)計相關(guān)引物（表1），T1和T2用于擴增TGEV的S基因，PS1和PS2用于擴增PEDV 的S基因中和抗原表位序列（1 495—1 914 bp）。引物由上海捷瑞生物科技有限公司合成。

表1　TGEV和PEDV擴增引物Table 1 Primers for TGEV and PEDV

1．3 樣品處理

將采回的樣品用PBS（pH＝7" 2）稀釋后凍融3次，4℃12 000 r/min離心15 min，取上清200 μL按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板分別進行TGEV和PEDV的PCR擴增（98℃2 min，98℃10 s，55℃10 s，72℃1 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min）。擴增產(chǎn)物經(jīng)1" 5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．4 PEDV S基因的克隆與序列測定

選擇條帶最亮的1株P(guān)EDV（CHNJPK2015株）的PCR產(chǎn)物進行純化回收，克隆于pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化E．coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，以PCR法鑒定重組質(zhì)粒，陽性質(zhì)粒交寶生物工程（大連）有限公司測序。

1．5 PEDV S蛋白中和表位基因遺傳進化分析

采用DNAStar軟件對測得的CHNJPK2015株P(guān)EDV S蛋白中和表位基因序列與我國其他地區(qū)的分離株、國外分離株（表2）的PEDV S蛋白中和表位基因進行同源性分析，采用MegAlign軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

表2　用于進行S蛋白中和抗原表位基因序列比較的PEDV毒株Table 2 PEDV strains for sequence comparison of neutralizing antigen epitope gene of S protein

2 結(jié)果與分析

2．1 臨床樣品檢測

利用RT-PCR的方法對9個發(fā)生典型腹瀉的豬場進行病原檢測，結(jié)果表明：9個豬場PEDV檢測陽性率為100％，36份病料中的23份樣品檢出PEDV，個體陽性率為63" 89％，而TGEV均未檢出（表3），說明本次流行的仔豬腹瀉病主要是由PEDV感染引起的。

表3　9個豬場的腹瀉病原檢測Table 3 Detection of TGEV and PEDV in 9 pig farms

2．2 PEDV S蛋白中和表位基因的擴增

以病料提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此為模板進行PEDV S基因的擴增，擴增產(chǎn)物用1" 5％的瓊脂糖電泳凝膠檢測，目的片段約為651 bp（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。

M：DNA Marker 2000；1：PEDV S gene圖1　豬流行性腹瀉病毒CHNJPK2015株S基因的RT-PCR擴增Fig．1 RT-PCRamplification of S gene of PEDV strain CHNJPK2015

2．3 PEDV S蛋白中和抗原表位基因序列分析

利用GeneBank上登錄的CV777（AF353511" 1）作為參考，分析S蛋白抗原位點堿基的變化，發(fā)現(xiàn)了4個堿基的變化（T1501C，C1508T），導(dǎo)致1個位點的氨基酸發(fā)生改變（S503L）。

2．4 CHNJPK2015株S蛋白中和抗原表位基因序列同源性及進化樹分析

測序后用DNAStar軟件對CHNJPK2015株S蛋白抗原表位基因進行序列分析，結(jié)果表明：所測毒株與參考毒株可分為3個群，CHNJPK2015株與AVCT12、Br1/87、CHM2013、LZC、SM98等毒株的遺傳距離較近，核苷酸序列同源性達99" 5％—99" 8％，處于同一群；而與2014年中國各地分離的CH/GDZQ/2014、FJ-FQ 2014、FJ-ZP 2014、PEDV-LY、PEDV-WS、PZ1406、SC1402、SH1404和疫苗株CV777序列的遺傳距離較遠(yuǎn)，核苷酸序列同源性為92" 9％—96" 2％，處于不同的群；1999年分離自韓國的Chinju99則自成一群（圖2）。

3 討論

張志等［5］對我國2011—2013年腹瀉豬群的組織樣品進行PEDV、TGEV和PRoV等3種常見病原學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)3種導(dǎo)致腹瀉的病原中，PEDV的陽性率最高達94" 6％。盧冰霞等［6］應(yīng)用RT-PCR方法對2011 年1月至2014年4月采自廣西14個不同地區(qū)的331份仔豬腹瀉糞便樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)腹瀉仔豬糞便樣品中有210份為PEDV陽性，總體陽性率為63"44％。本研究調(diào)查了江蘇、安徽、山東9個發(fā)生腹瀉的豬場的病原流行情況，在36份腹瀉樣品中，PEDV陽性率為63"89％（23/36），豬場陽性率為100％（9/9），均未檢出TGEV，說明豬流行性腹瀉病毒廣泛存在，仍然是近期我國豬群發(fā)生腹瀉的主要病原。

S蛋白是PEDV重要的結(jié)構(gòu)蛋白，也是主要的抗原蛋白，其核心中和抗原表位經(jīng)乳酸桿菌表達或從煙草中獲取的重組COE蛋白均與PEDV天然抗原具相同反應(yīng)原性［7］，說明PEDV中和抗原表位在其防控和診斷中均具有重要的作用。本研究通過對豬場分離的PEDV CHNJPK2015株S蛋白中和抗原表位基因的分析，發(fā)現(xiàn)分離的CHNJPK2015株與2014年我國各地分離的CH/GDZQ/2014、FJ-FQ 2014、FJ-ZP 2014、PEDV-LY、PEDV-WS、PZ1406、SC1402、SH1404和疫苗株CV777序列的遺傳距離較遠(yuǎn)，而與泰國2010年的分離株AVCT12的遺傳距離較近。王隆柏等［8］分析了在福建省流行的豬流行性腹瀉病毒S、N和ORF3的遺傳變異情況，發(fā)現(xiàn)7株分離于2012—2013年的PEDV毒株的S和ORF3基因與2008年泰國流行株的親緣關(guān)系比較近。以上研究說明我國流行的PEDV毒株可能來源于泰國，這一情況值得思考和研究。

［1］朱迪國，宋建德，袁麗萍，等" 2013—2014年全球豬流行性腹瀉重大疫情分析［J］"中國動物檢疫，2014，31（10）：42-46"

［2］Kang T J，Seo J E，Kim D H，et al" Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants［J］" Protein Expr Purif，2005，41（2）：378-383"

［3］Chang S H，Bae J L，Kang T J，et al" Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus［J］" Mol Cells，2002，14（2）：295-299"

［4］Kim S Y，Song D S，Park B K" Differential detection of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus by duplex RT-PCR ［J］" J Vet Diagn Invest，2001，13（6）：516-520"

［5］張志，董雅琴，劉爽，等"我國部分省份豬流行性腹瀉的流行病學(xué)監(jiān)測［J］"中國動物檢疫，2014，31（10）：47-51"

［6］盧冰霞，秦毅斌，何穎，等" 2011年—2014年廣西豬流行性腹瀉病毒檢測及其M基因的序列分析［J］"中國畜牧獸醫(yī)，2015，42（3）：549-557"

［7］董麗娜，高鳳山，許崇波，等"表達豬流行性腹瀉病毒COE基因的重組乳酸菌的構(gòu)建與鑒定［J］"畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2008，39（12）：1743-1747"

［8］王隆柏，林裕勝，車勇良，等"豬流行性腹瀉病毒S、N和ORF3基因的遺傳變異分析［J］"畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2014，45（11）：1830-1836"

（責(zé)任編輯：閆其濤）

Detection of porcine epidemic diarrhea virus and analysis of neutralizing antigen epitope gene of S protein

DING Wei-xing1，WANG Rong-tan1，GUO Jia-hong2，LIAO Xue-wen2，MIAO De-nian2*
（1Shanghai Ruifeng Agro-Technology Company Limited，Shanghai 201106，China；2Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China）

Abstract：Detection of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）and transmissible gastroenteritis virus （TGEV）in diarrhea samples（fresh feces and intestinal tissue，etc"）of 9 pig farms form Jiangsu，Anhui，Shandong in 2015 were conducted by RT-PCR，and the neutralizing antigen epitope gene of spike protein of isolated PEDV strain（CHNJPK2015）was cloned，sequenced and genetic evolution analyzed" The results showed that the positive rate of PEDV in 9 pig farms was 100％，the individual positive rate of PEDV was 63" 89％，no TGEV was detected，indicating that the diarrhea disease was mainly caused by PEDV this time" The tested strain and reference strains could be divided into 3 groups" The neutralizing antigen epitope gene of S protein of CHNJPK2015 and AVCT12，Br1/87，CHM2013，LZC，SM98 strains showed near genetic distance，the nucleotide sequence homology of them were 99" 5％—99" 8％，belonging to the same group" But the neutralizing antigen epitope gene of S protein of CHNJPK2015 and CH/GDZQ/2014，F(xiàn)J-FQ 2014，F(xiàn)J-ZP 2014，PEDV-LY，PEDV-WS，PZ1406，SC1402，SH1404，vaccine strain CV777 isolated in 2014 showed far genetic distance，the nucleotide sequence homology of them were 92" 9％—96" 2％，belonging to different groups"

Key words：Porcine epidemic diarrhea virus；Spike protein；Phylogenetic tree

*通信作者，E-mail：18918162235＠163" com

作者簡介：丁衛(wèi)星（1965—），男，本科，推廣研究員，主要從事農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣研究工作。Tel：021-62209501

基金項目：上海市科技支撐項目（13391901500）

收稿日期：2015-06-23

文章編號：1000-3924（2016）01-019-04

中圖分類號：S852" 65

文獻標(biāo)識碼：A