RNA干擾大腸癌相關(guān)信號通路基因表達的研究進展

劉蓮花，劉模榮，董輝，金海，文國榮，徐靖宇(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000)

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·綜述·

RNA干擾大腸癌相關(guān)信號通路基因表達的研究進展

劉蓮花，劉模榮，董輝，金海，文國榮，徐靖宇(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000)

摘要：基因沉默指外源性基因在細(xì)胞內(nèi)不表達或低表達狀態(tài)。RNA干擾屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默，在基因功能研究上，RNA干擾已成為最強大的基因剔除遺傳工具。近年來，對與大腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的相關(guān)信號通路研究日益增多，其中wnt/β-catenin、STATS信號通路、TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、RAS/MARK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、磷脂腺激醇3-激酶等信號通路的異常改變在大腸癌發(fā)生及發(fā)展中最常見。RNAi有高效性及特異性的特點，在腫瘤治療中廣泛應(yīng)用。RNAi對大腸癌細(xì)胞的作用包括靶向預(yù)制外源基因和內(nèi)源基因。通過大腸癌細(xì)胞生長分化相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路多個基因的共同序列抑制多個基因表達，并通過干擾細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵蛋白的表達，從而達到預(yù)制大腸癌細(xì)胞的生長。

關(guān)鍵詞：大腸癌；基因沉默；RNA干擾；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

2014年美國癌癥學(xué)會統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，大腸癌已成為全球僅次于乳腺癌和肺癌最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率因地區(qū)不同而存在較大差異[1]。因大腸癌早期無明顯特異性臨床癥狀及體征，多數(shù)患者就診時已處于中晚期，目前主要采取手術(shù)治療為主、放化療為輔的治療方式，有遠處轉(zhuǎn)移的大腸癌治療效果及預(yù)后均不佳[2]。隨著分子生物學(xué)及基因工程的發(fā)展，RNA干擾(RNAi)作為一種生物分子技術(shù)在腫瘤疾病治療領(lǐng)域得到重視。研究表明降低腫瘤的發(fā)生率，提高癌癥治療效果及改善癌癥患者生存率可通過RNAi及有效敲除腫瘤基因的表達得以實現(xiàn)[3]，因此進一步尋找新的治療靶點已成為提高大腸癌患者生存率及改變其生存率的重點問題。

1RNAi的研究背景及作用機制

基因沉默是調(diào)控真核生物細(xì)胞基因表達的手段，指因外源基因在轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因動物體細(xì)胞內(nèi)并未丟失或損傷，但該基因不表達或表達量極低的現(xiàn)象。RNAi屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默，RNAi主要作用機制是基因表達的相應(yīng)mRNA被小片段雙鏈RNA(dsRNA)高效特異性降解,從而特異性阻斷相應(yīng)基因表達[4]。研究者于1995年在對線蟲的試驗中發(fā)現(xiàn)正義RNA與反義RNA均可阻斷par-1表達，稱為RNAi。Fire等證明RNAi屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默，之后RNAi在植物及哺乳動物體內(nèi)相繼被發(fā)現(xiàn)。RNAi是由特定小RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，其中小RNA包括內(nèi)源性微小RNA(micRNA)、外源性小干擾RNA(siRNA)或短發(fā)卡RNA(shRNA)[5]，根據(jù)靶dsRNA的合成方法將RNAi技術(shù)分為體外化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、體內(nèi)載體合成法三種。近年來，在基因功能研究上，RNAi已成為最廣泛及最強大的基因剔除工具，成為腫瘤相關(guān)疾病的治療熱點。RNAi具有高效性和特異性的特點，成為大腸癌基因治療研究領(lǐng)域的新方法。RNAi技術(shù)中特異性的siRNA載體分兩類：①病毒siRNA表達載體，如慢病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒等。②siRNA質(zhì)粒表達載體或陽離子脂質(zhì)體包裹的siRNA。因siRNA質(zhì)粒表達載體的轉(zhuǎn)染效率低及陽離子脂質(zhì)體包裹的siRNA具有細(xì)胞毒性，而病毒siRNA 表達載體因有較低的免疫原性及細(xì)胞毒性，已成為基因治療研究領(lǐng)域的理想工具。有研究證實RANi的作用機制可能與部分酶和蛋白有關(guān)，如RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)、dsRNA 特異性核酸內(nèi)切酶(Dicer)、Argonaute 蛋白等。通過研究這些酶與蛋白在細(xì)胞基因表達及調(diào)控機制，進一步闡明RNAi可能的作用機制與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)有關(guān)：①RISC是由siRNA與核酸內(nèi)外切酶、解旋酶、ATP、 Argonaute蛋白連接在一起形成有多個亞單元沉默復(fù)合體。通過轉(zhuǎn)染技術(shù)將dsRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)，較長的dsRNA在細(xì)胞體內(nèi)通過Dicer的RNA酶Ⅲ樣特異性核酸內(nèi)切酶切割，產(chǎn)生21～23 nt 的siRNA，5′-磷酸和3′-羥基分別分布于siRNA兩條單鏈末端，且 3′端均有2～3個突出的核苷酸，能與其他蛋白質(zhì)及酶結(jié)合 形成RISC。RISC中的降解酶應(yīng)用ATP解開siRNA雙鏈，使靶向的mRNA上與之相匹配的特異性序列與解開的siRNA 反義互補結(jié)合，RISC中的核酸降解靶細(xì)胞中的mRNA，從而使目的基因沉默，即產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象。②siRNA亦可與RISC和mRNA結(jié)合在一起，在siRNA雙鏈被接開后，反義RNA鏈以 mRNA 為模板作為雙鏈 RNA 合成的一個引物，在RdRP作用下形成新的dsRNA ,再次被 Dicer 識別并切割,形成新的siRNA 再循環(huán)，這樣不斷放大的作用形式能作用于其他更多的靶向mRNA，使siRNA在短時間內(nèi)快速并有效抑制靶向基因蛋白質(zhì)或多肽的合成。

目前RNA干擾存在的問題：①在構(gòu)建siRNA序列過程中，如何找到效果最好的siRNA序列。②如何提高所構(gòu)建的特異性siRNA轉(zhuǎn)染效率。③如何解決外源性的siRNA在體內(nèi)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)及拮抗效應(yīng)[6]。④如何減少siRNA在體內(nèi)的脫靶效應(yīng)等。

2影響大腸癌發(fā)生的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

大腸癌相關(guān)信號通路的異常與大腸癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。影響大腸癌的相關(guān)信號通路有Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、STATS信號通路、TGF-β/Smads信號通路、RAS/MARK信號通路、絲裂原蛋白激酶信號通路(ERK-MAPK信號通路)、mTOR信號通路、TGF-β/Smad4信號通路、水通道蛋白-5(AQP-5)、凋亡及細(xì)胞核因子-κBp65(NF-κB p65)信號通路、磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)信號通路、鈣離子信號通路、MAPKs/NF-1κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、hedgehog信號通路、BMP7-Ids信號通路等。其中wnt/β-catenin、STATS信號通路、TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、RAS/MARK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、磷脂腺激醇3-激酶等信號通路的異常改變在大腸癌發(fā)生及發(fā)展中最常見。RNAi有高效性及特異性的特點，在腫瘤治療中廣泛應(yīng)用。RNAi對大腸癌細(xì)胞的作用包括靶向預(yù)制外源基因和內(nèi)源基因。通過大腸癌細(xì)胞生長分化相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路多個基因的共同序列抑制多個基因表達，并通過干擾細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵蛋白的表達，從而達到抑制大腸癌細(xì)胞的生長[7，8]。

3RNA干擾Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因表達

Wnt/β-catenin是腫瘤細(xì)胞發(fā)生過程中關(guān)鍵的信號通路之一，尤其在大腸癌細(xì)胞生長、遷移及分化中起重要作用。其通過穩(wěn)定β-catenin蛋白[9]，從而促進基因表達及細(xì)胞增殖。調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路的關(guān)鍵蛋白如Axin2、APC及β-catenin的異常改變，使Wnt/β-catenin不能被磷酸化及降解，Wnt/β-catenin在大腸癌細(xì)胞中大量聚集并進入細(xì)胞核與TCF-LEF結(jié)合調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖，使該通路在無Wnt刺激的狀態(tài)下仍能處于激活狀態(tài)，從而激活相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄且對腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移起促進作用?？沟蛲龅鞍譩cr與β-catenin結(jié)合形成復(fù)合物，通過負(fù)向調(diào)節(jié)β-catenin激活的轉(zhuǎn)錄基因，促進腫瘤細(xì)胞的生長。有學(xué)者通過構(gòu)建β-catenin的siRNA轉(zhuǎn)染到大腸癌細(xì)胞HCT166和SW480中，后通過相關(guān)試驗技術(shù)檢測出被siRNA感染的大腸癌細(xì)胞HCT166和SW480分別存在β-catenin和APC突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA后的兩株大腸癌細(xì)胞中β-catenin和β-catenin相關(guān)基因的表達顯著降低，且癌細(xì)胞增殖明顯受抑[10,11]。Ressd等通過將bcr的siRNA敲出基因轉(zhuǎn)染到大腸癌HCT-166細(xì)胞株內(nèi)，激活了轉(zhuǎn)錄基因c-myc表達，證實bcr在Wnt信號通路中可作為腫瘤抑制基因。

4RNA干擾PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因表達

PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在大腸癌細(xì)胞惡性增殖、轉(zhuǎn)移及血管新生中起重要作用，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是由一個催化亞基p110h和一個調(diào)節(jié)亞基p85構(gòu)成。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。已有研究表明，p85和Akt2在大腸癌腺體中呈高表達。在正常細(xì)胞中，抑癌基因PTEN可抑制PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但在大腸癌細(xì)胞中PTEN表達下降，使PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制受限，從而導(dǎo)致大腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力得不到很好的控制。Rychahou等分別用p110和p85的siRNA轉(zhuǎn)染至人大腸癌KM20和HT-29細(xì)胞株中，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞凋亡增加及增殖能力下降。

5RNA干擾TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因表達

TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為TGF-β經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與大腸癌細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移及凋亡密切相關(guān)。TGF-β即轉(zhuǎn)換生長因子β，是生長因子超家族中的一種，近期研究表明TGF-β1可通過抑制大腸腫瘤對免疫細(xì)胞的滲透作用逃脫機體的免疫監(jiān)視而促進腫瘤形成[12]。TGF-β1也可調(diào)節(jié)血管的生成從而促進大腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。TGF-β對大腸癌細(xì)胞的增生或凋亡作用決定癌細(xì)胞的變異情況。Smads復(fù)合物通過與不同的DNA結(jié)合蛋白或共轉(zhuǎn)錄因子相互作用，Smads的變異可促進大腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，其中Smad4蛋白是該信號通路的關(guān)鍵蛋白，其變異可使TGF-β/Smad轉(zhuǎn)變成促進腫瘤細(xì)胞生長的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[13]。通過構(gòu)建Smad4-shRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸癌細(xì)胞HCT-166細(xì)胞中，Smad4基因沉默后轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增殖力及侵襲能力明顯增強，早期凋亡率明顯降低，S期細(xì)胞增多，且Smad4基因可能與大腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。

6RNA干擾 STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因表達

STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路即信息轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子，其中STAT-6、STAT-3均屬于信息轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子家族的重要成員[14]。STAT是生長因子、細(xì)胞因子及非受體酪氨酸激酶等多個致癌性酪氨酸激酶的匯集焦點，該信號通路的過度激活使其下游靶基因的調(diào)節(jié)異常，從而使大腸癌細(xì)胞增殖、分化和凋亡產(chǎn)生異常，導(dǎo)致腫瘤形成。STAT6信號通路可通過抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡從而促進腫瘤細(xì)胞的發(fā)展。張明生等通過沉默STAT6特異性基因，構(gòu)建Sh質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人大腸癌HT-29細(xì)胞株中，從而阻斷STAT6信號通路的傳導(dǎo)，后試驗證明被轉(zhuǎn)染過STAT6特異性shRNA的大腸癌細(xì)胞中Bcl-2基因表達明顯減少，Bax蛋白基因增多，癌凋亡明顯增加[15]。Qian等[16]通過構(gòu)建針對STAT3基因的shRNA表達載體,轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中，試驗證實通過特異性沉默STAT3基因表達,可有效地抑制大腸癌細(xì)胞增殖，并使結(jié)腸癌細(xì)胞阻滯于G0、G1期并誘導(dǎo)其凋亡，癌細(xì)胞侵襲能力明顯降低。

7RNA干擾RAS/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因表達

RAS蛋白包括K-RAS、N-RAS及H-RAS，多數(shù)大腸癌中均有K-RAS變異[17]，其中主要表現(xiàn)為B-RAF及K-RAS變異,導(dǎo)致GTP不能水解[18]，使RAS-GTP處于持續(xù)活化狀態(tài)，從而導(dǎo)致RAS/MAPK信號通路活性增強，最終激活絲裂原活化蛋白激酶MAPK，從而促進大腸癌的發(fā)生和發(fā)展。研究者通過Rac1-shRNA載體質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染到結(jié)直腸細(xì)胞株(LoVo、SW480、SW620、SW1116、HT29)，后試驗表明以上被轉(zhuǎn)染特異性Rac1-shRNA大腸癌細(xì)胞侵襲移動能力受到抑制，癌細(xì)胞中Rac1蛋白不表達,細(xì)胞周期進程受抑制,阻滯于G0、G1期，細(xì)胞凋亡明顯增加。

8RNA干擾新型鈣離子轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因表達

瞬時性受體電位通道(TRP)超家族中，TRPV是其超家族中的重要成員之一，其中TRPV5、TRPV6是TRPV中惟一已知鈣離子高選擇性通道，在有鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運功能的器官中表達，其中主要表達于前列腺、乳腺、腎臟、小腸上皮等器官中，而人結(jié)腸癌細(xì)胞株(Sw480)中亦有表達，TRPV6表達高于TRPV5表達，在早期結(jié)腸癌中TRPV6有66%過表達[19]。有研究認(rèn)為鈣缺乏可促進TRPV6在小鼠十二指腸黏膜的表達[20]，促進鈣的吸收對結(jié)腸癌有防御作用[21]。有學(xué)者通過用TRPV6特異性siRNA轉(zhuǎn)染后的結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2試驗，發(fā)現(xiàn)該結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖減少40%，且細(xì)胞凋亡增加了原本的兩倍以上[22,23]。亦有試驗表明，通過激動劑25(OH)2D3和抑制劑劑(CuCl2)的作用可使大腸癌細(xì)胞凋亡增加，而細(xì)胞內(nèi)鈣離子明顯增加，與既往增加鈣離子的吸收可預(yù)防結(jié)腸癌報道說法不同。對于在結(jié)腸癌細(xì)胞中過表達的TRPV6來說，可通過構(gòu)建TRPV6特異性shRNA暫無進一步研究。進一步通過實驗證明新型鈣離子通道與結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡等形態(tài)變化，是否與鈣離子的增加或減少有直接聯(lián)系仍有待于進一步研究。

綜上所述，有多數(shù)研究是通過阻斷信號通路，影響大腸癌細(xì)胞生長所需物質(zhì)關(guān)鍵蛋白質(zhì)的生成，從而抑制癌細(xì)胞的增殖。部分研究證實RNA干擾相關(guān)信號通路基因的表達而使抑癌基因處于激活狀態(tài)，從而促進癌細(xì)胞的增殖和遷移。也有部分研究表明阻斷信號通路對癌細(xì)胞的增殖或遷移并無直接影響，而是通過影響該基因上游或下游基因的表達從而影響癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展。RNAi的出現(xiàn)為我們在未知基因功能的檢測上提供重要的手段。大腸癌細(xì)胞的增殖、遷移或凋亡與相關(guān)信號通路變化密切相關(guān)，了解相關(guān)信號通路對與癌細(xì)胞發(fā)生及發(fā)展的機制，對大腸癌的預(yù)防和治療起到重要作用。

結(jié)合近幾年國內(nèi)外學(xué)者在RNAi技術(shù)研究結(jié)果，本文對既往在RNAi技術(shù)上存在的部分問題進行梳理：特異性siRNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，能否保證siRNA的穩(wěn)定性，研究證實高密度脂蛋白納米粒子明顯改善裸體siRNA的穩(wěn)定性，使其在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達[24,25]。

隨著科學(xué)技術(shù)水平的不斷發(fā)展，RNAi從體外細(xì)胞的培養(yǎng)研究模式走向?qū)嶓w試驗，甚至將RNAi用于作為大腸癌的有效治療手段都指日可待，對于臨床試驗來說，如何選擇一個最佳生物安全水平是至關(guān)重要的。對于有多基因參與的腫瘤相關(guān)疾病，siRNA適合的治療量及能否用多個基因的siRNA來治療腫瘤也是有待于進一步研究的問題。

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本刊2016年第56卷第5期“BNP聯(lián)合心肌酶譜檢測對冠心病危險分層和冠脈搭橋術(shù)療效的預(yù)測作用”一文的作者及單位更改為：劉志強1，2，劉寅1，楊劉順2，李英偉2，孫樹申2(1 天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2 天津市津南區(qū)咸水沽醫(yī)院)；通信作者：劉寅(E-mail： 1637767441@qq.com)。特此聲明。

本刊編輯部

(收稿日期：2015-11-28)

中圖分類號：R735.34

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)13-0092-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.037

通信作者：劉模榮(E-mail:zylmr@163.com)

基金項目：貴州省國際科技合作計劃項目(黔科合G字(2014)7014號)。