沙利度胺聯(lián)合表阿霉素對(duì)小鼠H22肝癌細(xì)胞增殖、侵襲與凋亡的影響

高軍，祝小英，石慶芳，王大慶，姜達(dá)(衡水哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院，河北衡水053000;河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院)

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·基礎(chǔ)研究·

沙利度胺聯(lián)合表阿霉素對(duì)小鼠H22肝癌細(xì)胞增殖、侵襲與凋亡的影響

高軍1，祝小英1，石慶芳1，王大慶1，姜達(dá)2(1衡水哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院，河北衡水053000;2河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院)

摘要：目的探討沙利度胺聯(lián)合表阿霉素對(duì)小鼠肝癌p2細(xì)胞的增殖、侵襲與凋亡的影響。方法 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠p2肝癌細(xì)胞，隨機(jī)分為4組，分別加入生理鹽水(生理鹽水組)、沙利度胺50 μg/mL(沙利度胺組)、表阿霉素5 μg/mL(表阿霉素組)及沙利度胺50 μg/mL聯(lián)合表阿霉素5 μg/mL(聯(lián)合組)，采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖抑制率，侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞穿透數(shù)，并采用流式細(xì)胞儀測(cè)算各組細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 聯(lián)合組p2細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率明顯高于另外三組(P均<0.05)，細(xì)胞穿透數(shù)顯著低于另外三組(P<0.05)。沙利度胺組細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率明顯低于表阿霉素組(P均<0.05)，細(xì)胞穿透數(shù)顯著高于表阿霉素組(P<0.05)。結(jié)論 沙利度胺能很好地協(xié)同表阿霉素抑制小鼠p2肝癌細(xì)胞的增殖及侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：肝腫瘤；沙利度胺；表阿霉素;小鼠

肝癌發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，在我國(guó)居于第2位[1]。肝癌的發(fā)展速度快、轉(zhuǎn)移力強(qiáng)，臨床治療效果及預(yù)后欠佳[2]。沙利度胺是目前被證實(shí)的具有血管生成抑制作用的藥物，其曾因致畸作用而被禁用，但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其具有抗血管生成及免疫調(diào)節(jié)作用，大量研究發(fā)現(xiàn)其在胃癌、原發(fā)性肝癌及多發(fā)性骨髓瘤等治療中均有一定效果，并有相關(guān)研究證實(shí)其通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)部分生長(zhǎng)因子表達(dá)而發(fā)揮作用[3～5]。2009年6月～2013年9月，我們觀察了沙利度胺及表阿霉素干預(yù)后對(duì)小鼠p2肝癌細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的影響。

1材料與方法

1.1材料小鼠p2肝癌細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院提供，置于pH 7.2～7.4(含10%胎牛血清及2.5 mmol/L谷氨酰胺)DMEM/F12培養(yǎng)基(上海拜力生物科技)中，于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培育箱中，飽和濕度條件下常規(guī)無(wú)菌培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，無(wú)退化，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。沙利度胺片劑(江蘇常州制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字：h12026129)，研成粉末狀，懸于生理鹽水中配制混懸液；注射用鹽酸表阿霉素(輝瑞制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字：p0000496)，生理鹽水配制1 mg/mL實(shí)驗(yàn)用液。MEM液(Chemicon公司)，Annexin V-FITC(R&D公司)，PI(R&D公司)，二甲基亞砜(Sigma公司)。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(芬蘭Multiskan MK3)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Guava easyCyte 6-2L)。

1.2細(xì)胞增殖抑制率測(cè)算采用MTT法。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的p2細(xì)胞，用0.25%胰酶(Sigma公司)消化后離心制備單細(xì)胞懸液，以每孔8.0×104/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，200 μL/孔，加入培養(yǎng)液，邊緣孔加無(wú)菌PBS液，置于培養(yǎng)箱過(guò)夜。對(duì)照組加生理鹽水，沙利度胺及表阿霉素組分別加沙利度胺 50 μg/mL、表阿霉素 5 μg/mL，聯(lián)合組加沙利度胺 50 μg/mL、表阿霉素 5 μg/mL(沙利度胺、表阿霉素均溶于二甲基亞砜制備原液貯存待用)，每孔均為200 μL。37 ℃培養(yǎng)48 h時(shí)加入20 μL的MTT液(5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后出現(xiàn)結(jié)晶，吸去培養(yǎng)液加150 μL二甲基亞砜，搖床振蕩15 min，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm處檢測(cè)溶液吸光度(OD值)，重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.3細(xì)胞穿透數(shù)測(cè)算進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。Matrigel膠使用MEM液稀釋，取30 μL均勻包被Transwell小室，4 ℃過(guò)夜，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組、沙利度胺組、表阿霉素組及聯(lián)合組，分別加入生理鹽水、沙利度胺、表阿霉素、沙利度胺+表阿霉素，劑量同前，用無(wú)血清MEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后置入24孔板，上室加入5×103/200 μL無(wú)血清細(xì)胞懸液，下室加入500 μL的MEM培養(yǎng)液,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后，拭去基質(zhì)膠及上室細(xì)胞，4%多聚甲醛固定下室細(xì)胞，染色后顯微鏡觀察，取5個(gè)不同視野計(jì)數(shù)穿透細(xì)胞數(shù)取均值，重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞凋亡率測(cè)算取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期p2細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化，以4×105/mL接種至培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)吸去上清液，隨機(jī)分為對(duì)照組、沙利度胺組、表阿霉素組及聯(lián)合組，分別加入生理鹽水、沙利度胺、表阿霉素、沙利度胺+表阿霉素，劑量同前，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。PBS液清洗離心2遍，再次消化，收集所有細(xì)胞，70%乙醇(4 ℃預(yù)冷)固定30 min，PBS沖洗后加入5 μL Annexin V-FITC及10 μL PI溶液混勻置于流式管中，室溫避光溴化丙啶1 mL染色30 min后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA定量，并依據(jù)細(xì)胞周期分布檢測(cè)并計(jì)算出細(xì)胞凋亡率。

2結(jié)果

2.1各組肝癌p2細(xì)胞增殖抑制率比較見(jiàn)表1。

2.2各組肝癌p2細(xì)胞穿透數(shù)比較對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，排列緊密，透亮度好，沙利度胺組、表阿霉素組及聯(lián)合組細(xì)胞均排列較稀疏，懸浮細(xì)胞增多，細(xì)胞皺縮明顯，胞核固縮，形態(tài)改變，遮光能力降低。各組肝癌p2細(xì)胞穿透數(shù)比較見(jiàn)表1。

2.3各組肝癌p2細(xì)胞凋亡率比較見(jiàn)表1。

注：與生理鹽水組比較，*P<0.05；與表阿霉素組比較，△P<0.05；與聯(lián)合組比較，○P<0.05。

3討論

沙利度胺最初作為鎮(zhèn)靜藥物應(yīng)用于臨床，近年研究證實(shí)其具有抗血管生成及免疫調(diào)節(jié)作用。潘驥群等[6]研究發(fā)現(xiàn)其具有抑制bFGF及VEGF表達(dá)的作用，并提出沙利度胺具有抗血管生成作用。表阿霉素屬于抗生素類抗腫瘤藥物，其可干擾轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而抑制DNA及RNA合成，對(duì)多種實(shí)性腫瘤均有良好效果[7]。

浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特征，通過(guò)抑制血管增生來(lái)控制腫瘤的發(fā)展是一種有效的方法。腫瘤細(xì)胞的快速成長(zhǎng)有賴于新生血管的形成，并同時(shí)通過(guò)新生血管形成腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移途徑[8]。與傳統(tǒng)抗腫瘤治療相比，抗血管生成治療具有起效快、不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)勢(shì)。因此針對(duì)新生血管的靶向治療成為近年抗腫瘤治療的熱點(diǎn)[9]。

本研究我們發(fā)現(xiàn)，沙利度胺聯(lián)合表阿霉素對(duì)小鼠p2肝癌細(xì)胞增殖抑制較強(qiáng)，且在侵襲實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)用能顯著降低腫瘤細(xì)胞的穿透數(shù)，且流式細(xì)胞檢測(cè)證實(shí)聯(lián)合用藥能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，因此，沙利度胺聯(lián)合表阿霉素能對(duì)小鼠p2肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)起到明顯抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，沙利度胺作用后肝癌細(xì)胞DNA直方圖G1期峰前出現(xiàn)細(xì)胞凋亡峰亞G1期，揭示沙利度胺能很好地協(xié)助表阿霉素抑制小鼠p2肝癌細(xì)胞的增殖及侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能為其抑制肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制之一，王喜安等[10]研究發(fā)現(xiàn)沙利度胺治療小鼠HAC能明顯降低瘤重，抑瘤率為50.1%。

目前諸多實(shí)驗(yàn)證實(shí)沙利度胺聯(lián)合某種化療藥物可達(dá)到良好的協(xié)同作用，較藥物單用效果明顯。其抗腫瘤作用可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞DNA、RNA的合成，直接殺傷腫瘤細(xì)胞；兩藥聯(lián)用，一方面抑制腫瘤細(xì)胞本身的分裂增生，另一方面抑制腫瘤新生血管形成，減少瘤體營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，產(chǎn)生較好的腫瘤抑制效應(yīng)。

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基金項(xiàng)目：衡水市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目(09021Z)。

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.008

中圖分類號(hào)：R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)13-0023-02

(收稿日期：2015-10-28)