miR-7對乳腺癌細胞阿霉素耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及機制

路選，陳飛，王穎，李瑞青，高小康，孫鶴慶(揚州市第一人民醫(yī)院，江蘇揚州225000)

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miR-7對乳腺癌細胞阿霉素耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及機制

路選，陳飛，王穎，李瑞青，高小康，孫鶴慶(揚州市第一人民醫(yī)院，江蘇揚州225000)

摘要：目的探討microR (miR)-7對乳腺癌細胞阿霉素耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及可能的下游分子機制。方法采用ADR誘導(dǎo)體外人乳腺癌MCF-7細胞，建立阿霉素耐藥性MCF-7/ADR細胞株；MCF-7或MCF-7/ADR乳腺癌細胞轉(zhuǎn)染miR-7過表達載體(miR-7 mimic) 或干擾miR-7載體(miR-7 inhibitor)48 h后，阿霉素(100 ng/mL)處理24 h，MTT法測算細胞存活率；熒光定量PCR法測定miR-7和ABCC10 mRNA表達；蛋白免疫印跡法檢測ABCC10蛋白表達。結(jié)果MCF-7/ADR細胞表達低水平的miR-7和高水平的ABCC10。MCF-7/ADR過表達miR-7，ABCC10 mRNA 和蛋白表達受抑制，細胞的阿霉素敏感性增加，細胞活性下降；MCF-7低表達miR-7，ABCC10 mRNA和蛋白表達增加，細胞的阿霉素敏感性降低，而細胞活性增加。結(jié)論調(diào)控miR-7表達能逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞阿霉素耐藥性，其機制可能是miR-7通過調(diào)節(jié)ABCC10表達實現(xiàn)。

關(guān)鍵詞：乳腺癌；阿霉素；細胞活性；微小RNA-7；ABCC10蛋白

乳腺癌是威脅女性健康常見的惡性腫瘤[1]。盡管隨著預(yù)防篩查及診療技術(shù)的發(fā)展，乳腺癌的病死率明顯降低，但仍有部分乳腺癌患者發(fā)展為惡性腫瘤，其中主要原因是患者對初期化療無效，產(chǎn)生耐藥性[2]，如阿霉素耐藥。研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs是哺乳動物體內(nèi)普遍存在的一類非編碼小分子RNA，可通過對功能蛋白的表達調(diào)控，在乳腺癌的各類生理病理過程中發(fā)揮重要作用[3～5]。miR-7是調(diào)控乳腺癌發(fā)病的重要微小RNA(miRNA)[6,7]，可參與調(diào)控乳腺癌的治療[8]。ABCC10 是新近發(fā)現(xiàn)的ABC 家族，介導(dǎo)癌癥的多種藥物敏感性。2014年1～12月，我們通過調(diào)控人乳腺癌MCF-7和MCF-7/ADR細胞系miR-7表達，探討miR-7對乳腺癌細胞阿霉素敏感性的逆轉(zhuǎn)作用及其可能機制。

1材料與方法

1.1材料人乳腺癌MCF-7細胞株購自中國科學(xué)院細胞庫；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；阿霉素(美國Sigma公司)；兔抗人ABCC10多克隆抗體、FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(美國Santa Cruz Technology公司)；β-Actin抗體(美國Abcam公司)；胰蛋白酶、RPIR細胞裂解液(美國Invitrogen公司)；miR-7和ABCC10引物(上海生物工程公司)；SYBR Green 試劑盒(大連寶生物科技公司)；PVDF膜(美國 Millipore 公司)；MTT比色試劑盒(美國 Becton, Dickinson and Company)；miR-7 mimic和miR-7 inhibitor(美國Thermo scientific 公司)。

1.2細胞培養(yǎng)和ADR耐藥細胞系的建立MCF-7細胞培養(yǎng)于10% FBS的RPMI1640 完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，以后每間隔3 d換液1次，待細胞增殖密度達90%左右時進行傳代培養(yǎng)。0.25%的胰酶消化貼壁細胞，離心后加入新的培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，制成5×107細胞懸浮液，取10 mL懸浮液接種至培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24 h后，加入阿霉素至其終濃度為10 ng/mL，孵育48 h，棄去培養(yǎng)基。新鮮培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h。如此反復(fù)培養(yǎng)，逐步提高阿霉素的作用濃度，最終獲得耐受500 ng/mL阿霉素的細胞系稱為MCF-7/ADR，并維持培養(yǎng)在含10 ng/mL阿霉素的完全培養(yǎng)基。

1.3MCF-7及MCF-7/ADR細胞中miR-7表達檢測采用熒光定量PCR法。將貼壁生長的MCF-7及MCF-7/ADR細胞用胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基終止消化，離心棄上清，加裂解液反復(fù)吹打使細胞懸浮、裂解；氯仿-異戊醇法提取細胞裂解中的RNAs；分光光度法檢測RNA樣品的純度和濃度，260 nm/280 nm吸光度比值1.8～2.0視為RNA純度合格；根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，取2 μg的RNA樣本，制備20 μL反轉(zhuǎn)錄體系，在反轉(zhuǎn)錄酶催化下，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；取1 μL的cDNA樣本，制備50 μL定量PCR反應(yīng)體系，其中包含SYBR Green Ⅰ熒光和miR-7 和ABCC10 mRNA 的引物，經(jīng)歷94 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性25 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共35個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束之后72 ℃再延伸5 min。升溫速率為0.4 ℃/次，恒溫時間為30 s/次，制作熔解曲線，用于評價PCR擴增的特異性。miR-7的內(nèi)參基因為U6，相對表達量的計算采用2-ΔΔCt法。

1.4MCF-7及MCF-7/ADR細胞中ABCC10 mRNA、蛋白表達檢測采用蛋白免疫印跡法。取貼壁培養(yǎng)的MCF-7細胞，PBS清洗后，根據(jù)蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白；Bradford法對蛋白進行定量；等量40 μg蛋白樣品加入2X蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性5 min；樣品加入SDS-PAGE凝膠中進行電泳，60 V濃縮膠電壓，110 V分離膠電壓；電泳結(jié)束后進行PVDF轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束，清洗膜，封閉液常溫封閉非特異性結(jié)合蛋白2 h；一抗4 ℃孵育過夜；二抗室溫孵育2 h；根據(jù)超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒說明書，結(jié)合凝膠成像儀，檢測ABCC10蛋白條帶，以β-actin為內(nèi)參，比較不同處理的細胞中ABCC10蛋白表達水平。

1.5miR-7 mimic 和miR-7 inhibitor轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期的MCF-7及MCF-7/ADR細胞，以細胞密度為5×105/孔接種于6孔板，待細胞生長至密度為50%～60%時按照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將100 nmol/L的miR-7 mimic (miR-7 mimic組)或pre-NC(pre-NC組)轉(zhuǎn)染至MCF-7/ADR；miR-7 inhibitor(miR-7 inhibitor組)或NC(NC組)轉(zhuǎn)染至MCF-7，孵育 48 h收集細胞，參照1.3、1.4中方法檢測miR-7、ABCC10蛋白表達。

1.6細胞活性檢測 采用MTT法。取miR-7 mimic 或miR-7 inhibitor處理后的細胞懸浮液，加入5、10、20、40 ng/mL或0.5、1、2、4 ng/mL的阿霉素。細胞置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。然后再培養(yǎng)液中加入二甲基亞砜，振蕩溶解，置于自動酶標(biāo)儀570 nm處測各孔吸光密度(OD)。

2結(jié)果

2.1MCF-7及MCF-7/ADR細胞中miR-7和ABCC10蛋白表達比較miR-7在乳腺癌細胞MCF-7、耐阿霉素乳腺癌細胞MCF-7/ADR中的相對表達量分別為1、0.28±0.04，ABCC10 mRNA在乳腺癌細胞MCF-7、耐阿霉素乳腺癌細胞MCF-7/ ADR中的相對表達量分別為1、2.90±0.26，與MCF-7相比，P均<0.01。

2.2miR-7過表達的MCF-7/ADR細胞中ABCC10 mRNA表達ABCC10 mRNA在miR-7過表達的MCF-7/ADR細胞中的相對表達量為0.36±0.04，與Pre-NC轉(zhuǎn)染組對比，miR-7 mimic轉(zhuǎn)染MCF-7/ADR細胞，過表達miR-7，抑制了ABCC10 mRNA和蛋白表達。

2.3miR-7抑制表達的MCF-7細胞中ABCC10 mRNA表達ABCC10 mRNA在抑制miR-7表達的MCF-7細胞中的相對表達量為2.70±0.21，與NC轉(zhuǎn)染相比，miR-7 inhibitor轉(zhuǎn)染MCF-7細胞抑制miR-7表達，引起ABCC10 mRNA和蛋白表達上調(diào)。

2.4MCF-7/ADR細胞過表達miR-7后細胞活性轉(zhuǎn)染miR-7 mimic增加了MCF-7/ADR對阿霉素的敏感性，細胞活性顯著下降。Pre-NC組5、10、20、40 ng/mL阿霉素干預(yù)MCF-7/ADR細胞后細胞活性分別為95.3±2.1、84.7±3.5、75.3±4.5、63.3±5.0，miR-7 mimic組5、10、20、40 ng/mL阿霉素干預(yù)MCF-7/ADR細胞后細胞活性分別為88.7±4.5、66.3±4.2、49.0±4.6、37.0±0.0，兩組10、20、40 ng/mL阿霉素干預(yù)后細胞活性比較，P均<0.01。

2.5抑制miR-7表達對細胞活性的影響轉(zhuǎn)染miR-7 inhibitor減弱了MCF-7/ADR對阿霉素的敏感性，細胞活性增加。NC組0.5、1、2、4 ng/mL阿霉素干預(yù)MCF-7/ADR細胞后細胞活性分別為89.0±4.0、63.3±2.1、48.7±5.5、27.7±2.5，miR-7 inhibitor組0.5、1、2、4 ng/mL阿霉素干預(yù)MCF-7/ADR細胞后細胞活性分別為92.3±3.1、80.3±3.1、69.7±4.2、55.7±5.0，兩組1、2、4 ng/mL阿霉素干預(yù)后細胞活性比較，P均<0.01。

3討論

目前化療或輔助化療仍是治療乳腺癌的重要手段。部分患者由于對化療的抵抗性導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)死亡。阿霉素是用于乳腺癌的主要化療藥物，其機制是通過抑制腫瘤細胞生長和促進細胞凋亡來控制腫瘤。如何控制乳腺癌細胞的阿霉素耐藥性是目前亟待解決的問題。

miRNA是真核細胞中普遍存在的一類小分子RNA，長度約22 bp，主要參與功能基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，通過與目標(biāo)基因的mRNA結(jié)合，介導(dǎo)mRNA的降解或抑制mRNA翻譯。研究發(fā)現(xiàn)，超過50%的miRNA基因位于癌相關(guān)的基因組區(qū)域，miRNA在腫瘤發(fā)生機制中扮演重要角色。腫瘤組織中miRNA表達處于低水平亦或高水平，調(diào)控致癌基因或抑癌基因的表達。miR-7 被認為是多種腫瘤的抑制分子，包括腎上腺皮質(zhì)癌[9]、宮頸癌[10]和乳腺癌[11]等。近期，miR-7被認為可調(diào)控肺癌[12]等腫瘤的化療敏感性，但其對乳腺癌的阿霉素敏感性的調(diào)控鮮有報道。ABCC10水平影響腫瘤的生長、遷移,同時亦是介導(dǎo)多種腫瘤化療敏感性的功能蛋白[13]。因此，我們推測miR-7可能調(diào)控ABCC10表達，并參與乳腺癌細胞的阿霉素敏感性調(diào)節(jié)。

miRNA mimic 是一種化學(xué)合成的RNA寡核苷酸，可模擬內(nèi)源miRNA，提高細胞內(nèi)miRNA水平，增強miRNA的功能。另外，miRNA inhibitor 作為特異性靶miRNA的抑制劑，導(dǎo)致內(nèi)源性miRNAs表達降低。因此，miRNA mimic 和miRNA inhibitor 常用來操縱miRNA表達，進行miRNA功能研究。在我們的實驗中，MCF-7/ADR 細胞中miR-7表達下降，所以我們在MCF-7/ADR 中轉(zhuǎn)染miRNA-7 mimic，在MCF-7細胞中轉(zhuǎn)染miR-7 inhibitor, 結(jié)果顯示，miR-7過表達抑制了MCF-7/ADR細胞的ABCC10 mRNA和ABCC10蛋白表達，表明miR-7可負向調(diào)控ABCC10表達。另外，miR-7過表達增加了MCF-7/ADR細胞的阿霉素敏感性，引起細胞活性降低；干擾miR-7增強了MCF-7細胞的阿霉素活性，導(dǎo)致細胞活性下降。由此可見，上調(diào)miR-7表達可增加MCF-7的阿霉素化療敏感性，其可能機制是通過調(diào)控ABCC10表達實現(xiàn)。

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Reverse offect of miR-7 on adriamycin resistance of breast cancer cells

LUXuan,CHENFei,WANGYing,LIRuiqing,GAOXiaokang,SUNHeqing

(TheFirstPeople'sHospialofYangzhou,Yangzhou225000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the reverse effect of microR (miR)-7 on adriamycin resistance of breast cancer cells and its downstream molecule mechanism. MethodsHuman breast cancer MCF-7 cell line was exposed to gradually increasing density of adriamycin (ADR) that was used to establish ADR-resistant MCF-7/ADR cell line. MCF-7 or MCF-7/ADR cells were transfected with miR-7 mimic or miR-7 inhibitor for 48 h. Then cells were exposed to ADR (100 ng/mL) for 24 h. MTT assay was used to evaluate cell survival, fluorescent quantitative PCR was used to determine miR-7 and ABCC10 mRNA expression and immunoblotting was used to determine ABCC10 protein expression. ResultsMCF-7/ADR cell expressed lower level of miR-7 and high level of ABCC10. MiR-7 overexpression in MCF-7/ADR cell inhibited ABCC10 mRNA and protein expression and enhanced ADR resistance thereby leading to the reduction of cell viability. In the contrary, silencing miR-7 in MCF-7 promoted ABCC10 mRNA and protein expression and increased cell viability.ConclusionRegulating MiR-7 expression may reverse the ADR resistance of breast cancer cells and its mechanism may be that miR-7 reverses ADR resistance by regulating ABCC10 expression.

Key words:breast carcinoma; adriamycin; cell viability; microRNA-7; ABCC10 protein

(收稿日期：2015-12-24)

中圖分類號：R737.9

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)13-0020-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.007

第一作者簡介：路選(1980-)，男，主治醫(yī)師，主要研究方向為乳腺腫瘤的理論與臨床研究。E-mail：xuanlulx@163.com