三七總皂苷對重癥急性胰腺炎大鼠的治療作用及機(jī)制

盛國濤，李雙喜，莫小華(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，昆明 650101)

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三七總皂苷對重癥急性胰腺炎大鼠的治療作用及機(jī)制

盛國濤，李雙喜，莫小華(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，昆明 650101)

摘要：目的觀察三七總皂苷對重癥急性胰腺炎(SAP)大鼠的治療作用，并探討其機(jī)制。方法 選取SD大鼠30只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO組)、重癥胰腺炎組(SAP組)、三七總皂苷干預(yù)組(PNS組)，每組各10只，經(jīng)膽胰管逆行注射5%?；悄懰徕c制備大鼠SAP模型。SO組進(jìn)腹后僅翻動(dòng)胰腺和十二指腸后關(guān)腹，不注入5%牛磺膽酸鈉，其中PNS組模型建立后立即予腹腔注射三七總皂苷50 mg/mL，SO組、SAP組建模后注射生理鹽水0.1 mL/100 g。各組大鼠分別于建模后4 h檢測血清淀粉酶(AMS)，光鏡下觀察胰腺組織病理學(xué)改變，免疫組化SP法檢測胰腺組織中NF-κB及炎癥因子TNF-α表達(dá)。結(jié)果與SO組相比，PNS組和SAP組大鼠血清AMS水平、胰腺組織病理學(xué)評分、NF-κB和TNF-α表達(dá)量顯著升高(P均<0.05)；與SAP組相比，PNS組大鼠血清AMS水平、胰腺組織病理學(xué)評分、NF-κB和TNF-α表達(dá)量顯著降低(P均<0.05)；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，胰腺組織腺泡細(xì)胞內(nèi)NF-κB與TNF-α因子表達(dá)呈正相關(guān)(r分別為0.958、0.992、0.989，P均<0.05)。結(jié)論 三七總皂苷能減輕SAP的胰腺損傷，其機(jī)制可能為抑制胰腺組織NF-κB因子激活，減少炎性細(xì)胞因子過度釋放。

關(guān)鍵詞：重癥急性胰腺炎；三七總皂苷；核轉(zhuǎn)錄因子κB；腫瘤壞死因子α

重癥急性胰腺炎(SAP)在發(fā)病時(shí)除胰腺自身變化外，還會(huì)引起其他臟器功能異常，損傷胰外器官如肺、肝、腎等多種臟器，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，甚至?xí)l(fā)生多臟器功能衰竭(MOF)，病死率極高[1，2]，治療棘手。目前對胰腺炎的發(fā)病機(jī)制尚無明確解釋。隨著國內(nèi)外眾多學(xué)者的深入研究，NF-κB因子過度激活被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的重要核心環(huán)節(jié)，抑制其活化可能有助于降低SAP的病死率。目前中藥在治療胰腺炎方面已取得較好效果，其中三七總皂苷目前研究較多。2015年7月，我們通過建立大鼠胰腺炎模型，給予三七總皂苷進(jìn)行預(yù)干預(yù)，觀察三七總皂苷對SAP的治療作用，并探究其相關(guān)機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級SD大鼠30只，體質(zhì)量200～250 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主要藥品與試劑：注射用三七總皂苷(血塞通注射液)購自云南植物藥業(yè)有限公司；?；悄懰徕c購自美國Sigma公司；10%水合氯醛由昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科提供；NF-κB p65多克隆抗體購自SANTA CRUZ公司。

1.2分組、造模及干預(yù)將30只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO組)、急性重癥胰腺炎組(SAP組)、三七總皂苷干預(yù)組(PNS組)3組，每組10只。SAP組、PNS組動(dòng)物模型使用并改良經(jīng)腸壁逆行胰膽管注射法，術(shù)前禁食24 h，但不禁水。術(shù)前使用生理鹽水將?；悄懰徕c(ST)配制成5%的ST溶液，用于建模。準(zhǔn)備好血塞通注射液。使用乙醚吸入麻醉，麻醉成功后，仰臥位固定大鼠于手術(shù)臺(tái)上。腹部常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，作手術(shù)標(biāo)記。取上腹部正中切口長1～2 cm，逐層入腹，翻動(dòng)十二指腸尋找大鼠胰膽管，探查十二指腸乳頭位置，明確胰膽管走行。辨認(rèn)十二指腸降部腸管壁內(nèi)潛行的胰膽管，用無損傷絲線結(jié)扎肝門處膽管，辨認(rèn)出十二指腸乳頭處，使用針頭在其對側(cè)腸壁穿刺后退針。用預(yù)先去尖鈍針頭1 mL注射器插入腸腔，探查十二指腸乳頭，經(jīng)十二指腸乳頭逆行穿刺入胰膽管并向前推進(jìn)約0.5 cm，針頭使用無損傷血管夾固定。以0.2 mL/min的速度向胰膽管內(nèi)注入5% ST(0.1 mL/100 g)，注射完畢后2～3 min肉眼觀察確認(rèn)大鼠胰腺組織水腫，顏色變?yōu)榇u紅色或灰白色等改變，即建模成功，拔出注射針頭前解開結(jié)扎在肝門部的無損傷絲線。皮下注射生理鹽水(0.1 mL/100 g)補(bǔ)液，逐層關(guān)腹。其中SO組模型制作：進(jìn)腹后僅翻動(dòng)胰腺和十二指腸后關(guān)腹，不注入5%牛磺膽酸鈉；PNS組模型制作：建模方式與SAP組相同，但在關(guān)腹前使用50 g/mL血塞通注射液(0.1 mL/100 g)注入腹腔后逐層關(guān)腹。SO組及SAP組大鼠腹腔內(nèi)注射等量生理鹽水(0.1 mL/100 g)。在建模后4 h處死大鼠，心臟采血，經(jīng)腹腔取胰腺組織標(biāo)本。

1.3血清淀粉酶(AMS)檢測心臟采血，采血量約5 mL。將血清離心15 min，-80 ℃下保存。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清AMS。

1.4胰腺組織病理學(xué)評分經(jīng)腹腔取胰腺組織，取大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm胰腺組織用10%甲醛溶液固定，送往昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，由病理科醫(yī)師進(jìn)行蘇木素-伊紅染色。光鏡下觀察并采用改良的Grewal和Schmidt等方法對SAP大鼠胰腺組織損傷進(jìn)行定量評估。

1.5胰腺組織腺泡細(xì)胞內(nèi)NF-κB和TNF-α表達(dá)檢測 采用免疫組化SP法檢測胰腺組織細(xì)胞內(nèi)NF-κB和TNF-α因子表達(dá)，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。胰腺組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核或細(xì)胞膜染有棕黃色或棕褐色顆粒為陽性，結(jié)果采用圖像分析軟件Image pro plus進(jìn)行分析，測平均光密度，通過平均光密度值反映胰腺組織內(nèi)NF-κB、TNF-α表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1三組血清AMS水平比較SO組、SAP組、PNS組血清AMS水平分別為(885.2±202.33)、(3 134.12±331.05)、(2 661.15±324.72)U/L，三組間兩兩比較，P均<0.05。

2.2三組胰腺組織病理學(xué)評分比較SAP組、PNS組大鼠胰腺組織均出現(xiàn)腫脹、滲出、點(diǎn)狀出血壞死。SO組、SAP組、PNS組胰腺組織損傷評分分別為(2.3±0.47)、(13.1±1.35)、(6.7±1.29)分，三組間兩兩比較，P均<0.05。

2.3三組胰腺組織中NF-κB/p65陽性細(xì)胞、TNF-α表達(dá)比較SO組、SAP組、PNS組NF-κB /p65陽性量分別為(33.16±3.22 )、(72.20±7.76)、(47.28±3.72)Pu，TNF-α表達(dá)量分別為0.079±0.011、0.334±0.018、0.145±0.009，三組間兩兩比較，P均<0.05。

2.4胰腺組織腺泡細(xì)胞內(nèi)NF-κB與TNF-α表達(dá)的相關(guān)性SO組、SAP組、PNS組胰腺組織腺泡細(xì)胞內(nèi)NF-κB與TNF-α表達(dá)存在正相關(guān)性(r分別為0.958、0.992、0.989，P均<0.05)。

3討論

SAP作為外科常見的急腹癥，病情發(fā)展兇險(xiǎn)，病死率較高，臨床治療棘手。造成SAP治療瓶頸的主要原因是其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未明確。研究表明，SAP在病程早期由于胰酶的大量釋放，損傷胰腺細(xì)胞及小血管壁，引起多種炎癥介質(zhì)的釋放，改變血管通透性導(dǎo)致胰腺水腫、出血、壞死，繼而引發(fā)嚴(yán)重的SIRS和多器官功能不全綜合征(MODS)等[3]。

“細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)”是人們在SAP研究中發(fā)現(xiàn)并了解較早的致病因素。大量研究表明，部分炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子在體內(nèi)含量的多少與SAP病情輕重和最終病死率呈正相關(guān)。目前關(guān)于炎癥學(xué)說的研究已較為成熟，大量的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)中以TNF-α與SAP的關(guān)系最為密切。TNF-α是由機(jī)體內(nèi)各種炎癥細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞產(chǎn)生的。其主要作用可通過對機(jī)體免疫功能的影響，使機(jī)體腫瘤細(xì)胞受到干擾，同時(shí)還可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝功能來影響正常細(xì)胞的生長和分化。在SAP病情發(fā)展中，TNF-α起重要作用。在對臨床100例患有SAP的患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)[4]，在患病90 d內(nèi)由于各種并發(fā)癥死亡的患者入院時(shí)血清TNF-α含量是死亡患者的63倍；同時(shí)發(fā)現(xiàn)SAP合并有MODS較單純的SAP患者血清中TNF-α含量高出191.5倍?？梢奣NF-α是反映SAP嚴(yán)重輕度及預(yù)后情況的較好指標(biāo)。TNF-α在各種炎癥反應(yīng)中均起到重要作用，其可破壞上皮組織的保護(hù)屏障，增加其通透性。這樣可使其他炎癥介質(zhì)、炎癥細(xì)胞通過屏障到達(dá)炎癥組織，最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重，組織損傷[5]。NF-κB由Sen等[6]于1986年在B淋巴細(xì)胞核中提取并檢測出來，其在SAP發(fā)病過程中對炎癥的發(fā)生發(fā)展起到重要作用。在SAP反應(yīng)中NF-κB可激活大量炎癥因子，如腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、趨化因子、黏附分子和集落刺激因子等炎癥因子，可促進(jìn)瀑布炎癥反應(yīng)[7，8]。

近年來，運(yùn)用中藥及天然藥物治療SAP在動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)方面均取得一定進(jìn)展[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與SO組相比，PNS組和SAP組大鼠血清AMS水平、胰腺組織病理學(xué)評分、NF-κB和TNF-α表達(dá)量顯著增高；與SAP組相比，PNS組大鼠血清AMS水平、胰腺組織病理學(xué)評分、NF-κB和TNF-α表達(dá)量顯著降低；相關(guān)性分析結(jié)果顯示胰腺組織腺泡細(xì)胞內(nèi)NF-κB與TNF-α因子的表達(dá)呈正相關(guān)，提示三七總皂苷注射液可能通過抑制NF-κB表達(dá)，從而抑制TNF-α等炎性因子的分泌，有助于SAP的治療。當(dāng)前大量的臨床觀察和實(shí)驗(yàn)研究表明三七總皂苷在胰腺炎的治療方面有著較顯著效果。有學(xué)者[10]使用烏司他丁聯(lián)合三七總皂苷治療SAP大鼠，觀察大鼠血清中TNF-α和IL-1β在組織中表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SAP大鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-1β表達(dá)明顯升高，單獨(dú)三七總皂苷和烏司他丁均可抑制其表達(dá)，但以兩者聯(lián)用的治療效果最為理想，說明三七總皂苷對SAP治療效果可通過抑制炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。

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Effect of panax notoginseng saponins in treatment of rats with severe acute pancreatitis

SHENGGuotao,LIShuangxi,MOXiaohua

(TheSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalCollege,Kunming650101,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of panax notoginseng saponins in treatment of rats with severe acute pancreatitis (SAP), and to explore the mechanism.MethodsThirty SD rats were randomly divided into three groups: sham operation group (SO group ), severe acute pancreatitis group (SAP group), PNS preconditioning group (PNS group), and there were 10 rats in each group. Rat SAP models were induced by retrograde injection of 5% taurocholic acid sodium to pancreatic duct. SO group was just treated with pancreas and duodenum turning after abdominal closure without injection of 5% taurocholic acid sodium. The rats in the PNS group were given intraperitoneal injection of 0.1 mL/100 g PNS 50 mg/mL (xuesetong injection 0.1 mL/100 g) after the models were established. And rats in the other two groups were given normal saline (0.1 mL/100 g). The serum AMS were detected at 4 hours after modeling, we observed the pathological changes of pancreatic tissues under the light microscopy. The expression of nuclear transcription factor-κB (NF-κB) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) was detected by immunohistochemical SP method.ResultsCompared with the group SO, serum AMS levels, pathology scores of pancreatic tissues and the expression of NF-κB and TNF-α were significantly increased in the groups PNS and SAP (all P<0.05), and those in the SAP group rats were significantly higher than those in the PNS group (all P<0.05). The expression of NF-κB was positively correlated with TNF-α expression in the pancreas acinar cells (r=0.958, 0.992 and 0.989, all P<0.05).ConclusionsPanax notoginseng saponins may reduce the pancreatic injuries of SAP rats. Panax notoginseng saponins may have protective effect on SAP rats by inhibiting the activation of NF-κB and reducing the excessive release of inflammatory factors.

Key words:severe acute pancreatitis; panax notoginseng saponins; nuclear transcription factor-κB; tumor necrosis factor-α

(收稿日期：2015-11-17)

中圖分類號：R576

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)13-0017-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.006

通信作者簡介：莫小華(1963-)，教授，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)橐认偌膊?。E-mail:120638905@qq.com

第一作者簡介：盛國濤(1989-)，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)楦文懸韧饪茖W(xué)臨床治療。E-mail:1454846616@qq.com

基金項(xiàng)目：昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(2007C138M)；昆明醫(yī)科大學(xué)研究生創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(2015S91)。