銅綠假單胞菌耐藥機制及中醫(yī)藥治療研究進展

丁雪霏 丁軍穎 趙京霞, 郭玉紅，3,4 劉清泉,,4

(1 首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京，100010； 2 北京市中醫(yī)研究所，北京，100010； 3 中醫(yī)感染性疾病基礎研究北京市重點實驗室，北京，100010； 4 北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院，北京，101300)

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銅綠假單胞菌耐藥機制及中醫(yī)藥治療研究進展

丁雪霏1丁軍穎2,3趙京霞1,2,3郭玉紅1，3,4劉清泉1,2,3,4

(1 首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京，100010； 2 北京市中醫(yī)研究所，北京，100010； 3 中醫(yī)感染性疾病基礎研究北京市重點實驗室，北京，100010； 4 北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院，北京，101300)

隨著抗生素的不規(guī)范使用，近年細菌耐藥率越來越高。臨床尤以感染性疾病的多見病原菌——銅綠假單胞菌最為突出，不僅是臨床急危重癥的棘手問題，也是國際醫(yī)學界的難題和焦點。為此，作者綜述了近5年來銅綠假單胞菌耐藥機制研究進展，并對β-內酰胺酶、主動外排系統(tǒng)、密度感應系統(tǒng)等主要耐藥機制著力闡述，進而闡釋相關的中醫(yī)藥治療措施，以期為抗生素治療無果時探索中醫(yī)藥治療思路提供依據(jù)。

銅綠假單胞菌；β-內酰胺酶；主動外排系統(tǒng)；密度感應系統(tǒng)；中醫(yī)藥

銅綠假單胞菌(Pseudomonas Aeruginosa，PA)屬假單胞菌屬，革蘭氏陰性桿菌，是醫(yī)院感染的主要條件致病菌，能引起各種感染性疾病，是臨床常見致病菌。2014年CHINET細菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，該菌在臨床感染致病菌的檢出率居第四位。近年，由于抗菌藥物的不規(guī)范使用，其耐藥率逐年遞增，多藥耐藥數(shù)量和耐藥率也逐年攀升，成為臨床治療的難題，尤其為急危重癥的治療帶來了極大困擾。PA已逐漸成為院內感染多重耐藥的代表性革蘭氏陰性菌，耐藥機制尤其復雜。

1 銅綠假單胞菌耐藥機制

1.1 獲得性耐藥 PA能夠通過整合子、轉座子等可移動遺傳單位獲得外源耐藥基因，并整合到自己的染色體中進行轉錄，從而獲得耐藥。整合子在整合酶催化作用下將游離耐藥基因盒整合到59 bp特異性識別位點上，特異性整合的耐藥基因盒可被自由整合或切除，非特異性整合則不可。國內外多項研究表明，Ⅰ類整合子最常見，Ⅱ、Ⅲ類整合子比較少見。Ⅰ類整合子中研究最多的為磺胺類耐藥基因dfrAs，是最常見的基因盒，其次為氨基糖苷類耐藥基因aadA，β-內酰胺類耐藥基因等其他基因盒檢出率很低[1-2]。同時，Ⅰ類整合子的3個開放閱讀框中溴乙錠耐藥基因(qacE△l)與磺胺耐藥基因(sull)檢出率很高，可作為Ⅰ類整合子的標志基因[3]。整合子能夠在同類生物中水平轉移，且自然轉換可以促進其在不同物種之間轉移[4]，加之人類不斷發(fā)現(xiàn)新的基因盒，表明整合子可以通過其基因的靈活性和多樣性適應環(huán)境，廣泛傳播，成為多重耐藥菌迅速發(fā)展的重要原因。

1.2 固有耐藥 PA通過滅活酶、膜通透性下降、主動外排系統(tǒng)過度表達、藥物作用的靶位改變、產(chǎn)生生物膜及密度感應系統(tǒng)等機制對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥。

1.2.1 產(chǎn)生滅活酶 PA可產(chǎn)生β-內酰胺酶、氨基糖苷類修飾酶、氯霉素乙酰轉移酶等，其中β-內酰胺酶可使β-內酰胺類抗生素分子開環(huán)失活，是其主要的耐藥機制。β-內酰胺酶主要包括C類頭孢菌素酶(AmpC)、超廣譜β-內酰胺酶(estend-spectrumβ-lactamases，ESBLs)和金屬酶(metallo-β-lactamase，MBL)等。

1.2.1.1 β-內酰胺酶 1)ESBLs：ESBLs是一類由質粒介導的，能水解頭孢菌素類、青霉素類及單環(huán)類抗菌藥物，但對頭霉烯類、碳青霉烯類抗菌藥物及酶抑制劑敏感的β-內酰胺酶。ESBLs有2種分類方法，Ambler等人根據(jù)氨基酸序列的差別將其分為A、B、C、D四類，隨后Bush等人根據(jù)功能將其分為4個群，大多數(shù)ESBLs屬于前者的Ambler A類，后者的2be群，少數(shù)屬于前者Ambler D類，功能群的Bush-d類[5]。A類ESBLs可分為TEM、SHV、PER、VEB、GES、IBC型，雖底物譜相似，但其基因卻多半不同源，呈現(xiàn)出明顯的地域差異。屬于D類的OXA型ESBLs有3個基因來源，對不同抗菌藥物水解活性各有差異，且自報道以來，僅國內就至少有127個成員[6]。

ESBLs由質粒介導，其編碼基因大多位于質粒上，細菌可通過多種方式使ESBLs基因在細菌間水平轉移和傳播，還可將這些耐藥基因進行整合、重組，甚至可以將其整合到染色體上垂直傳播，形成多重耐藥，是銅綠假單胞菌耐藥性日趨嚴重的重要原因[7]。

2)AmpC酶：AmpC酶是一種不被克拉維酸抑制的絲氨酸頭孢菌素酶，水解底物首選頭孢菌素，分為染色體編碼和質粒編碼2種。染色體編碼的AmpC有可誘導性，即正常狀態(tài)下為低水平表達，在有誘導作用的β-內酰胺類抗生素存在時，產(chǎn)酶量會顯著上升。人們還在不斷地探索誘導AmpC產(chǎn)酶的因素，如一項國外研究發(fā)現(xiàn)，在編碼ApmC的染色體中插入ISAbal元件，此基因會提供高效啟動子blaAmpC基因，使其成為超表達AmpC酶[8]；另一項國內研究發(fā)現(xiàn)，密度感應系統(tǒng)QS中的las QS系統(tǒng)可能直接或間接影響AmpC的基因誘導表達[9]；此外，一些DNA結合蛋白如AmpR、AmpD可轉化為AmpC活化因子從而調節(jié)AmpC的表達。質粒編碼的AmpC酶自上世紀80年代被分離出以來，世界各地不斷發(fā)現(xiàn)MIR、ACT、DHA、CMY、FOX、MOX等新型質粒AmpC酶，且分布存在地區(qū)差異。MaiM.Helmy和Reham Wasfi用PCR擴增方法研究發(fā)現(xiàn)，CMY型為主要的AmpC酶，占143例孤立細菌的86.9%，其次為DHA、FOX、EBC、MOX[10]。質粒編碼的AmpC酶有更廣的水解底物，不水解碳青霉烯類抗菌藥物，多恒定表達，不受誘導[11]。

3)MBL：近年來，隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛應用，PA金屬β-內酰胺酶的耐藥性顯著上升。MBL依賴金屬鋅離子而發(fā)生催化活性，能夠水解除單環(huán)類幾乎所有的β-內酰胺酶類抗菌藥物，其編碼基因廣泛存在于染色體及質粒、轉座子、整合子等移動元件中，大部分通過可移動原件在細菌間水平傳播，少部分為垂直傳播，為臨床治療帶來極大的困難。目前已發(fā)現(xiàn)幾種MBL類型，包括IMP、VIM、SPM、GIM和SIM等，又包括若干亞型，其中IMP、VIM對臨床影響最大，二者均大部分位于整合子Ⅰ中，在細菌中水平傳播。IMP、VIM的分布存在地區(qū)差異，來自伊朗的一項研究表明，75%產(chǎn)MBL酶的銅綠假單胞菌均攜帶IMP基因，VIM型包括VIM-1、4、5、7、8、9等，其中VIM-1型則較VIM2型更為常見[12]，VIM-7可水解亞胺培南及青霉素；國內研究也表明IMP型所占比例最大，其IMP-1基因占24.21%，其他類型較為少見[13]。Tada等研究表明基因突變是IMP型銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥的重要原因[14]。

1.2.1.2 氨基糖苷類修飾酶 PA對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的原因包括產(chǎn)氨基糖苷類修飾酶、細菌16S rRNA基因甲基化酶和氨基糖苷類抗菌藥物作用靶位16S rRNA基因突變等，其中產(chǎn)AME為主要原因。16S rRNA基因甲基化酶可保護自身30S核糖體不與氨基糖苷類抗菌藥物結合，造成PA對所有氨基糖苷類藥物高度耐藥。氨基糖苷類修飾酶按功能可分為乙酰轉移酶(AAC)、磷酸轉移酶(APH)、核苷轉移酶(ANT)3類[15]，可對進入菌內的氨基糖苷類抗菌藥物進行修飾，使其失活。編碼AME的耐藥基因位于質粒及轉座子、整合子等移動元件中，常見的基因型有aac(3′)-Ⅱ、aac(6′)-Ⅰ、aac(6′)-Ⅱ、ant(2′′)-Ⅰ、ant(3′′)-Ⅰ、aph(3′)-Ⅵ等，其中aac(6′)-Ⅰ介導對妥布霉素和阿米卡星耐藥，aac(6′)-Ⅱ和ant(2′′)-Ⅰ對妥布霉素和慶大霉素耐藥，aph(3′)-Ⅵ對阿米卡星耐藥[16]。一項研究表明ant(2′′)-Ⅰ和aac(3′)-Ⅱa為最常見的基因型，分別占78.87%、47.88%，同時展示了不同基因與表型之間的關系[17]，這與國內研究并不相符[18]，說明耐藥基因存在地區(qū)差異，可能與使用抗菌藥物種類有關，需要我們有針對性的研究，為臨床合理選擇抗菌藥物提供支持。

1.2.2 膜通透性下降 PA細胞膜上有特異性孔蛋白，可作為滲透性小或滲透不完全的分子進入細菌體內的通道，當膜孔蛋白丟失或表達下降時，抗菌藥物則不能進入菌內，導致耐藥。膜特異性孔蛋白包括OprC、OprD、OprE、OprF、OprG和OprH[19]，OprD的高突變型和調節(jié)性使其成為PA耐碳青霉烯類抗菌藥物的最基本機制，其中OprD2的缺失或突變作為耐亞胺培南(IPM)的重要機制得到了國內外學者的廣泛重視。OprD2為亞胺培南的唯一特異性通道，可發(fā)生多點突變、缺失突變、插入突變，其中最常見的缺失、突變有2種：一種為編碼區(qū)395-405位11 bp DNA片段小缺失，引起移碼突變，導致復制提前終止；另一種為啟動子上游-519位到編碼區(qū)685位的1204 bp DNA片段的大缺失，不能轉錄mRNA，導致OprD2蛋白缺失，形成耐藥[20]。丁軍穎等通過實驗研究檢測北京中醫(yī)醫(yī)院2014年銅綠假單胞菌對20種抗生素的敏感性，發(fā)現(xiàn)有9株菌對20種抗生素均耐藥，但OPRD2耐藥基因表達率也并非100%[21]。OprD的表達水平除受MexT、CopR等基因調節(jié)，也受調控因子影響，如高水平的c-di-GMP通過減少OprD的量提高PA對抑菌濃度IPM的適應性，鋅離子通過CzcRS雙組份調節(jié)系統(tǒng)提高PA毒力等，其調控因子還有很多，值得我們進一步探索。

1.2.3 主動外排系統(tǒng)過度表達 PA細胞膜上的主動外排系統(tǒng)是一種質子泵，由3種蛋白構成：1)外膜通道蛋白，如OprM、OprJ、OprN等，位于細胞膜外，形成門通道，排出抗菌藥物；2)內膜蛋白，如MexB、MexD、MexF、MexY，可識別藥物并將其轉運出菌體，但無特異性；3)膜融合蛋白或輔助蛋白，如MexA、MexC、MexE、MexX等，連接內外膜蛋白。3者共同作用將抗菌藥物排出體外。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)4種主要的主動外排系統(tǒng)，包括MexAB-oprM、MexXY-oprM、MexCD-oprJ、MexEF-oprN，其中MexAB-oprM的研究最為深入，其次為MexXY-oprM。

MexAB-oprM是PA中發(fā)現(xiàn)的第一個RND型外排系統(tǒng)，在野生菌株中低表達，為固有耐藥機制之一，其水解底物最廣。MexAB-oprM由MexA、MexB、OprM 3種蛋白構成，均由同一操縱子mexO所編碼，受多種調控基因調節(jié)，如mexR、nalC、nalD，編碼阻遏蛋白mexR、nalC、nalD，當調控基因突變時，可使mexO失去抑制而增強表達，引起對β-內酰胺類、氟哇諾酮類抗菌藥物、四環(huán)素類和β-酰胺酶抑制劑的耐藥；其過表達也對美羅培南MIC影響明顯，卻幾乎不影響IMP。研究發(fā)現(xiàn)，QS系統(tǒng)也可影響MexAB-oprM的表達，當細菌數(shù)量達到10-7個/mL時，便會激活QS系統(tǒng)，誘導、增強MexAB-oprM轉錄和表達[22]。MexXY由MexX和MexY 2種蛋白組成，均由MexXY操縱子編碼，可借助OprM獲得自身缺失的外膜蛋白，因此MexAB-oprM表達降低可影響MexXY的活性。MexXY-oprM的阻遏調控基因為mexZ，其突變可導致對氨基糖苷類、紅霉素和氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥[23-24]。MexAB-oprM還可抑制OprD的轉錄，影響PA對亞胺培南的耐藥性。關于各主動外排系統(tǒng)之間的相互影響及與其他耐藥機制的互相作用仍需進一步研究。

1.2.4 靶位改變 抗菌藥物與細胞膜上特異性結合的靶位有青霉素結合蛋白(Penicillin-Binding-Proteins，PBP)、16 s核糖體RNA(16 sr RNA)和拓撲異構酶。PBP位于細胞內膜，參與合成細菌細胞壁肽聚糖，包括內肽酶、轉肽酶和羧肽酶，β-內酰胺類抗菌藥物可與之結合，干擾細胞壁生成，還可觸發(fā)PA的自溶酶活性。PBP結構分為兩部分：青霉素結合位點和非青霉素結合位點，PA主要通過PBP基因突變改變自身結構，使其與β-內酰胺類抗菌藥物親和力降低或消失而耐藥。有國外研究顯示，PBP還可以誘導AmpC酶高度表達[25]。截止到2013年在PA中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了8中PBP，其中PBP2和PBP3與耐碳青霉烯類抗菌藥物有關，實驗發(fā)現(xiàn)IMP對PBP2有高度依賴性，推測PBP2為IPM的作用靶點[26]。

1.2.5 生物膜 生物膜在PA耐藥機制中起到了重要作用，但其作用機制尚不完全清楚，目前主要有3種推論：滲透限制、營養(yǎng)限制和表型[27]。

滲透限制學說認為，生物被膜阻止了抗生素滲入，是有生物膜的PA耐藥的主要機制。生物膜外的基質屏障作用曾被認為是主要的耐藥機制：基質帶有大量陰離子，可吸附陽離子抗菌藥物；還帶有酶，可滅活部分抗菌藥物。當結合位點飽和或酶消耗殆盡時，抗菌藥物仍能通過機制屏障，且生物膜對氟喹諾酮類抗生素表現(xiàn)為高通透性，而敏感性卻遠低于浮游菌，所以該機制并不能完全解釋PA生物膜的耐藥機制。

營養(yǎng)限制學說認為，表層PA容易獲得養(yǎng)料氧氣，代謝率高，抗菌藥物多針對代謝活躍的細菌，因此表層細菌易被殺死；深層細菌因有基質包繞，不易獲得營養(yǎng)，代謝率低，且代謝產(chǎn)物不易排出，造成周圍環(huán)境偏酸，可使大部分抗菌藥物失活，二者共同作用，使深層細菌極難清除，當環(huán)境適宜時，殘留的深層細菌便會迅速繁殖。

表型推斷學說從基因角度解釋生物膜的耐藥機制。PA生物膜形成可分為5個階段，每個階段都有不同的基因激活產(chǎn)生獨特的表型，當影響抗菌藥活性的基因被激活時，便會對細菌耐藥性產(chǎn)生影響。例如細生物膜主要成分之一為藻酸鹽，由algD編碼合成，其基因突變可產(chǎn)生大量藻酸鹽，導致生物膜耐藥性大大增加，又能直接作用于宿主，抑制其免疫功能。該學說已成為生物膜耐藥機制的主要研究方向。

1.2.6 密度感應系統(tǒng) 密度感應系統(tǒng)(Quorum Sensing System，QS)是通過細菌密度來調節(jié)細菌生命活動的細胞間信號傳導系統(tǒng)，影響著PA外毒素、彈性蛋白酶、溶血素、生物膜、鼠李糖脂等多種致病因子的表達。PA中存在3個QS系統(tǒng)：受高絲氨酸(Acyl-homoserine Lactone，HSL)調控的Las、Rh1系統(tǒng)和喹諾酮信號系統(tǒng)(Pseudomonas Quinolone Signal，PQS)。Las系統(tǒng)激活LasI蛋白質轉錄，合成PA自誘導物3-氧代十二烷基-L-高絲氨酸內酯，與受體蛋白LasR結合啟動下游基因表達。Rh1系統(tǒng)由Ph1I合成的自誘導物N-丁酰-L-高絲氨酸內酯和受體Rh1R構成。兩系統(tǒng)雖有不同的調節(jié)因子，但LasR和Rh1R有大量的重疊，說明Las、Rh1系統(tǒng)并不完全獨立。PQS系統(tǒng)以2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮為信號分子，不依賴AHL，以分級調控的方式水平調控PA多種毒性因子的表達。3個系統(tǒng)之間也存在級聯(lián)調控關系，干擾QS系統(tǒng)會明顯降低PA的致病能力，探討QS系統(tǒng)之間及與外界環(huán)境的相互調節(jié)關系，將是以后研究的重點[28-30]。

2 中醫(yī)藥對銅綠假單胞菌的認識及治療

中醫(yī)學對銅綠假單胞菌感染有獨特的認識見解。早期普遍認為與伏邪相關。早在《黃帝內經(jīng)》就提到一類與時氣不合的疾病，這為后世伏邪學說奠定了基礎。吳又可在《瘟疫論》中首次提出伏邪概念，吳鞠通在《溫病條辨》中進一步詳細闡述，至清代，各醫(yī)家對伏氣溫病的認識已擴展到溫病以外的外感疾病。歷代醫(yī)家不斷完善伏邪學說，為現(xiàn)代中醫(yī)藥應用提供了豐富的理論支持。

伏邪治療原則為扶正透邪。因此，在治療耐藥菌感染時，不僅重視益氣養(yǎng)血扶正，更重要的是解毒清熱透邪外出。喻嘉言在《醫(yī)門法律·痢疾門》中指出——邪陷入里，雖百日之久，仍當引邪由里出表，若但從里去，不死不休。劉清泉教授的扶正透邪芪歸銀方同理而出，其運用中醫(yī)理論和辨證分型思維模式，積多年臨床實踐——始終以扶正透邪治則治療細菌性肺炎，據(jù)法遣方用藥而形成，已證實臨床療效肯定[30]。

中醫(yī)理論認為耐藥菌感染的核心病機是正氣不足、邪毒內伏，其臨床表現(xiàn)為虛實夾雜，多以氣血虧虛、氣機不暢為本，以血瘀、痰凝、濕熱夾雜為標，與伏邪致病特點相似。目前臨床治療此類疾病通常廣泛應用寒涼的抗生素及清熱解毒類中藥制劑，較少顧及患者正氣。馬明坤等人用清熱法對上呼吸道常見致病菌做了體外抑菌實驗(163株致病菌中包括17株銅綠假單胞菌)，以清熱合劑以銀翹散為底方進行加減，實驗表明清熱合劑對除外肺炎克雷伯菌之外的上呼吸道常見致病菌均有一定抑菌作用，其中對銅綠假單胞菌抑制作用最強，但總體效果仍差強人意[31]。劉清泉教授則認為扶正與祛邪并重，提倡鼓動正氣透邪外出。扶正透邪代表方劑芪歸銀，以黃芪配當歸益氣和營清熱，既避免苦寒傷陽，又可透邪外出，二者配伍，為當歸補血湯，氣血雙補，并可退虛熱；當歸和金銀花配伍，取自四妙勇安湯，補血活血，祛邪外出；結合青蒿退虛熱、除蒸熱；虎杖清熱化瘀，全方補而不膩，給邪以出路。臨床應用顯示，芪歸銀方可明顯減低感染者的死亡率[32]。芪歸銀在體外對銅綠假單胞菌無直接抑菌作用；但可降低頭孢他啶、頭孢哌酮舒巴坦、亞胺培南西司他丁鈉的MIC和MBC值，并對β-內酰胺酶水解具有明顯抑制作用[33]，可使耐亞胺培南的PA的敏感性得到一定程度恢復，從而逆轉其耐藥性[34]；同時證實，可調節(jié)機體免疫平衡，使感染所致的免疫紊亂趨于平衡[35]，相關機制有待進一步研究揭示。

3 展望

銅綠假單胞菌耐藥機制復雜，存在天然耐藥和獲得性耐藥，且可二者并存，這極大地加重了臨床治療困難，所以進一步深入研究闡明其確切耐藥機制，從而針對性發(fā)展治療措施勢在必行；同時，尤其在抗生素針對病原菌治療困境難脫時，中醫(yī)藥以人為本的扶正透邪治療理念也值得著力探索。

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(2016-09-12收稿 責任編輯：洪志強)

Research Progress on Resistance Mechanisms of Pseudomonas Aeruginosa and Treatment from Traditional Chinese Medicine

Ding Xuefei1, Ding Junying2,3, Zhao Jingxia1,2,3，Guo Yuhong1，3,4, Liu Qingquan1,2,3,4

(1BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing，100010,China; 2BeijingResearchInstituteofTCM,Beijing，100010,China; 3BeijingKeyLaboratoryofBasicStudyonTCMInfectionDisease，Beijing，100010,China; 4BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineShunyibranch,Beijing101300,China)

As the unreasonable application of antibiotics, the bacterial resistance rate is getting higher and higher, especially the pseudomonas aeruginosa, which was the main pathogenic bacteria in infectious diseases, and this was not only the difficult problem of clinical acute and severe diseases but also the trouble and focus internationally. Therefore, the resistant mechanism research progress of pseudomonas aeruginosa in the recent five years were reviewed. The main resistant mechanism of beta lactamase, active efflux system and quorum sensing system were focused on, and the relevant Traditional Chinese Medicine treatment were detailed, in order to provide a basis for exploring the Traditional Chinese Medicine treatment when antibiotic treatment has no efficacy.

Pseudomonas Aeruginosa; Beta Lactamase; Active Efflux System; Quorum Sensing System; Traditional Chinese Medicine

國家自然科學基金項目(編號：81373813；81503399)

R378.99+1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.10.004