嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）總抗體檢測試劑盒（ELISA）的研制

馬玉英

（寧夏賀蘭縣農(nóng)牧漁業(yè)局動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，寧夏銀川 750001）

嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）總抗體檢測試劑盒（ELISA）的研制

馬玉英

（寧夏賀蘭縣農(nóng)牧漁業(yè)局動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，寧夏銀川 750001）

為建立檢測嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）血清總抗體的雙抗原夾心ELISA方法并進(jìn)行初步試用。通過原核表達(dá)得到SFTSV-NP重組蛋白，以該蛋白作為ELISA的包被和酶標(biāo)記抗原，確定抗原的最佳包被濃度和血清稀釋度，優(yōu)化各項(xiàng)試驗(yàn)條件，在此基礎(chǔ)上研制試劑盒，并對(duì)試劑盒的重復(fù)性、特異性等方面進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗原最適包被濃度為4.0μg/ml，血清的最佳稀釋濃度為1∶40，重復(fù)性試驗(yàn)表明批內(nèi)和批間的變異性都低于10%。該試劑盒敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性良好，可應(yīng)用于SFTSV的研究和臨床檢測。

嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒；抗體；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、血清

SFTSV毒株、陽血清均由江蘇疾病預(yù)防控制中心病原微生物研究所保存。

1.1.2 引物、原核表達(dá)載體

引物、原核表達(dá)載體pET28a-NP均由江蘇疾病預(yù)防控制中心病原微生物研究所構(gòu)建。

1.1.3 試劑及主要儀器

病毒TRNA提取試劑TRIzol、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、等購自大連寶生物工程有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）、弗氏完全、不完全佐劑購自美國Sigma公司；PCR儀：德國Biometra公司產(chǎn)品；恒溫儀、離心機(jī)：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；DEM一Ⅱ自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)：北京拓普生產(chǎn)；MODEL680型酶標(biāo)儀；96孔可拆式ELISA酶標(biāo)板：丹麥NUNC公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 制備重組抗原

根據(jù)Trizol試劑說明書從血清中提取總RNA，通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出SFTSV-NP基因，分別用限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI酶切上述擴(kuò)增片段與質(zhì)粒pMD18-T，回收目的基因和載體片段，進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主菌E.coliDE3，挑取經(jīng)酶切鑒定的單個(gè)白色菌落，37℃培養(yǎng)至OD600nm為0.4～0.6時(shí)，加ITPG37℃誘導(dǎo)6h，收集菌體，純化目的蛋白，具體操作步驟參考文獻(xiàn)。

1.2.2 酶標(biāo)記抗原

對(duì)表達(dá)純化的NP重組蛋白采用過碘酸鈉法標(biāo)記辣根過氧化物（HRP），經(jīng)Supperdex200分子篩分離純化。

1.2.3 ELISA各項(xiàng)試驗(yàn)條件的優(yōu)化

（1）酶標(biāo)抗原的最佳使用濃度

將酶標(biāo)抗原進(jìn)行不同濃度的稀釋，各取1滴加入系統(tǒng)采用的1ml底物液中，迅速混勻后觀察顏色變化，在1～1.5min內(nèi)出現(xiàn)明顯顏色變化的二抗?jié)舛?，也就是最佳的酶?biāo)抗原使用濃度。

（2）在已確定的各種條件下，選擇適合的封閉液和稀釋液

分別用5～10%脫脂奶粉、5～10%馬血清、1%白明膠、1% BSA作封閉液；用1～5%脫脂乳、3～5%馬血清、0.1%白明膠、0.1%BSA作稀釋液，測450nm的OD值，選本底低、P/N值大、OD值最高者為最適。

（3）各個(gè)步驟作用時(shí)間的選擇（選擇本地值低、P/N比值最高者為最適作用時(shí)間）

包被條件：其他條件不變，選擇4℃過夜、37℃作用1h后4℃過夜、37℃作用2h，這3個(gè)梯度；

封閉時(shí)間：設(shè)0.5h、1h、2h、4h，共4個(gè)梯度；

血清樣品反應(yīng)時(shí)間：設(shè)10min、20min、30min、40min，共4個(gè)梯度；

酶標(biāo)抗原作用時(shí)間：設(shè)30min、1h、2h，共3個(gè)梯度；

顯色時(shí)間：設(shè)顯色時(shí)間分別為5min、8min、10min、12min、14min，共5個(gè)梯度。

（4）臨界值的確定

隨機(jī)挑取SFTSV抗體陽性血清20份，抗體陰性血清80份，以優(yōu)化的抗原包被量和血清工作濃度對(duì)血清進(jìn)行ELISA檢測，測定450nm的OD值，計(jì)算陰性血清的平均OD值（）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），求得陰陽性判定界限±3SD。

2 結(jié)果

2.1 重組抗原制備

原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-NP轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得表達(dá)蛋白與預(yù)期大小相符。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后純化獲得了較高純度的目的蛋白。

2.2 ELISA各項(xiàng)試驗(yàn)條件優(yōu)化結(jié)果

從方陣滴定法檢測結(jié)果表1可以看到，隨著包被抗原濃度的減少和血清稀釋倍數(shù)的增加，血清的OD值不斷降低，當(dāng)抗原包被濃度在4μg/ml，血清稀釋倍數(shù)為1：40時(shí)，陽性血清的OD值在1.0左右，且陰性血清的OD值低，陽性陰性血清比值（P/N）高。一般情況下，ELISA檢測儀在檢測OD值為1.0左右時(shí)誤差最小，反應(yīng)最靈敏，以此為根據(jù)我們選擇4μg/ml的抗原包被量為最適包被濃度，而被檢血清的最佳稀釋為1：40。

2.3 ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

實(shí)驗(yàn)測得陰性血清OD450nm均值范圍為0.12±0.03，在此基礎(chǔ)上確定該ELISA試劑盒的判定標(biāo)準(zhǔn)為S/N＞2.1，且陽性血清A450nm＞0.25時(shí)則待檢血清SFTSV總抗體為陽性。

2.4 特異性試驗(yàn)

對(duì)其有出血熱癥的陽性血清和20份陰性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陰性，沒有出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

2.5 敏感性試驗(yàn)

通過檢測倍比稀釋的陽性血清，結(jié)果顯示當(dāng)血清稀釋濃度達(dá)到1：640時(shí)，按以上判定標(biāo)準(zhǔn)判定仍為陽性，說明該試劑盒的靈敏度為1：640.

3 結(jié)語

本試驗(yàn)使用重組蛋白NP作為包被抗原和酶標(biāo)記抗原，建立了雙抗原夾心ELISA法，并對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上研制出ELISA試劑盒。通過對(duì)試劑盒的檢測表明其特異性良好，未于布尼亞其他病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，并且ELISA方法的成功建立克服了其他檢測法存在的缺點(diǎn)，該試劑盒的檢出率高，費(fèi)用少，對(duì)儀器及檢驗(yàn)員的要求不高，為試劑盒的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

［1］ 劉雅婷，張文超，李正躍，等.布尼亞病毒科全基因組序列比對(duì)分析［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，23（3）：315-320.

［2］ 陶文元，陶欣.新型布尼亞病毒感染致發(fā)熱伴血小板減少綜合征8例報(bào)告［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2011，21（1）：91-92.