偽狂犬病診斷方法研究進展及其應(yīng)用情況

莫偉強/長治市畜牧局 郭偉軍/山西隆克爾生物制藥有限公司

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偽狂犬病診斷方法研究進展及其應(yīng)用情況

莫偉強/長治市畜牧局 郭偉軍/山西隆克爾生物制藥有限公司

偽狂犬病(PR),又稱Aujeszky氏病,是由皰疹病毒亞科、水皰病毒屬的甲型皰疹病毒引起的危害多種家畜和野生動物的一種急性傳染病。新生仔豬死亡率可達(dá)100%。

偽狂犬病在1813年首次發(fā)生于美國的牛群中，1902年由匈牙利學(xué)者Aujeszk’s證明為病毒引起，1934年由Sabin和Wright確定為皰疹病毒。1947年劉永純在我國分離到PRV。目前該病呈世界分布，我國也廣泛流行，是當(dāng)前危害養(yǎng)豬業(yè)的最重要的傳染病之一。目前，PRV血清型只有一種。但近年來，PRV不斷發(fā)生變化，在流行過程中有毒力增強的現(xiàn)象。至今為止的所有疫苗都只能抑制臨診癥狀的出現(xiàn)，不能控制感染和排毒。動物一旦被感染，病毒可在動物體內(nèi)呈長期潛伏感染狀態(tài)，難以清除。有時，在受到體內(nèi)或外界因素的刺激后，病毒還可被重新激活而排毒傳播。因此,早期快速而準(zhǔn)確的檢測PRV致病毒株對有效控制PRV的流行具有重要意義。

一、病原學(xué)診斷

PRV病毒的分離鑒定被認(rèn)為是檢測病原的金標(biāo)準(zhǔn)，因該方法比較耗時，而且所需材料較高，一般作為新方法建立的驗證方法。常采用細(xì)胞培養(yǎng)方法分離病毒。采用病豬的腎臟、腦、肝、脾及扁桃體等組織，勻漿后加適宜的雙抗（青、鏈霉素）制成乳劑，離心（3 000 rpm）10 min，取上清液接種培養(yǎng)成致密單層的細(xì)胞，觀察直至出現(xiàn)特征性細(xì)胞病變（CPE），鏡檢觀察細(xì)胞中有無核內(nèi)包涵體。這種方法敏感性較差。

二、電鏡的病毒檢測

電鏡技術(shù)可以直觀、準(zhǔn)確的鑒別病毒，根據(jù)病毒的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和大小等不同特征，可以做出診斷。電鏡下，PRV病毒粒子為橢圓形或圓形，二十面體立體對稱。位于細(xì)胞核內(nèi)的無囊膜的病毒粒子直徑約110～150 nm，位于胞漿內(nèi)的帶有囊膜的成熟病毒粒子直徑約為150～180 nm，囊膜外有呈放射狀排列的纖突。該方法直觀、快速，但比較復(fù)雜，一般僅限于以研究為目的的應(yīng)用。

三、血清學(xué)診斷技術(shù)

（一）傳統(tǒng)血清學(xué)試驗

1.瓊脂免疫擴散試驗（AGID）。自從Gutekunst D E(1997)首次報道了利用微量瓊脂擴散試驗檢測豬血清中PRV抗體以來，由于AGID技術(shù)操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，無需特殊設(shè)備，與SNT技術(shù)相比有很大的優(yōu)勢，因此廣泛應(yīng)用于基層醫(yī)科獸研單位和大型豬場的現(xiàn)場定性診斷以及豬群陰性無感染的普查。吳斌等(1997)將AGID和SNT進行了比較試驗，發(fā)現(xiàn)與SNT的陽性符合率為94%，可以作為一種檢測偽狂犬病和抗體水平的檢測。代明娟等利用AGID技術(shù)對5個豬場進行了抗體檢測，結(jié)果分析表明豬場的血清陽性率為80.0%，顯示了AGID技術(shù)的簡便和快捷。

2.乳膠凝集試驗技術(shù)（LAT）。乳膠試驗?zāi)夹g(shù)是利用抗原和抗體特異性結(jié)合的特點，將抗原先用乳膠包被，然后再與相應(yīng)血清反應(yīng)，如幾分鐘內(nèi)發(fā)生凝集，可判定有PRV感染,幾分鐘內(nèi)即可得出結(jié)果。邱德新等應(yīng)用血清中和試驗(SNT)和偽狂犬病乳膠凝集試驗(LAT)診斷試劑盒進行了PRV抗體效價測定和相關(guān)性分析，結(jié)果表明兩種方法檢測結(jié)果符合率高，特異性強，LAT比SNT敏感、快速、簡便和實用。唐勇在克隆表達(dá)的基礎(chǔ)上建立了gG—LAT和gE—LAT試驗技術(shù)結(jié)果表明，gG—LAT特異性強、敏感性高,可用于區(qū)分gG基因缺失疫苗活苗免疫豬與自然感染野毒的血清學(xué)陽性豬；gE-LAT特異、敏感且重復(fù)性好，能顯著區(qū)分gE基因缺失疫苗免疫豬血清和野毒感染豬血清，可用于豬偽狂犬病的鑒別診斷。此法用時短、特異性較強、簡便、實用，利于基層獸醫(yī)單位和規(guī)模養(yǎng)豬場推廣應(yīng)用。LAT操作簡單、方便、快速，且敏感性高、特異性強，適用于疫病監(jiān)測或流行病學(xué)調(diào)查，以及種豬群檢疫凈化陽性豬初次篩選。

3.反向間接血凝試驗(RPHA)。程由銓等應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)，建立的RPHA檢測PRV抗原,并與VI比較，發(fā)現(xiàn)RPHA不僅特異性強，且與VI有同等的陽性檢出率。但RPHA試驗設(shè)備要求低，操作簡便，結(jié)果直觀，更適合于基層使用。

4.病毒中和試驗（NT）。作為病毒檢測的經(jīng)典方法，是世界上多數(shù)國家診斷PR的法定方法之一。通常應(yīng)用已知病毒檢查待檢血清中的特異性抗體，該方法操作簡便，可在PK15、雞胚成纖維細(xì)胞中進行。判定標(biāo)準(zhǔn)有觀察細(xì)胞病變、免疫熒光染色等多個標(biāo)準(zhǔn)，但結(jié)果往往帶有主觀因素。雖然NT有較高靈敏度，是一種常用的診斷方法。但該法操作繁瑣，工作量大，且受技術(shù)、細(xì)胞等條件限制，給臨床應(yīng)用帶來一定的困難。

（二）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ElISA）

ELISA檢測法已被廣泛應(yīng)用PRV的檢測，ELISA在PRV的早期感染、持續(xù)感染中均得到應(yīng)用，并可以同時用于特性抗原和抗體的檢測。在診斷方面，定期采血監(jiān)測正常豬群中PRV抗體的ELISA效價，當(dāng)豬群出現(xiàn)癥狀后，根據(jù)ELISA抗體升高的程度判斷是否存在感染PRV。母源抗體的存在對疫苗的免疫效果產(chǎn)生影響，常應(yīng)用ELISA檢測方法對疫苗免疫后血清中抗體的情況進行調(diào)查。

1.間接ELISA。Mout(1978)、A fshar(1987)、蔣玉雯(1988)等分別建立了檢測偽狂犬病病毒抗體的間接ELISA方法，因為ELISA敏感性高，且快速、簡便，適于大面積血清學(xué)調(diào)查。王勇等用gE鑒別ELISA試劑盒調(diào)查某豬場流行情況，母豬陽性率為81%，但缺點是此種方法費用昂貴，難以在基層推廣。

2.DOT-ELISA。該方法是一種以硝酸纖維素膜等固相化基質(zhì)膜為載體的ELISA,用于檢測抗體或抗原，具有簡便、經(jīng)濟、結(jié)果判定直觀等優(yōu)點，但是也存在結(jié)果判斷主觀性強的不足。李克榮（1989）、李健強(1990)等分別應(yīng)用混合纖維素酯微孔濾膜作固定支持物，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的SPA建立了斑點-ELISA(DOT—ELISA)，該法檢測PRV抗體具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，使ELISA方法可用肉眼觀察結(jié)果。其敏感性明顯高于SN，適合大面積血清學(xué)普查。該法不僅繼承了常規(guī)ELISA的優(yōu)點，而且還具有抗原用量少、節(jié)省材料、不需特殊儀器、結(jié)果便于長期保存、快速簡便等優(yōu)點。

3.單克隆抗體夾心ELISA。單抗夾心ELISA是將單抗的特異性與ELISA方法相結(jié)合起來,使其特異性和敏感性大大提高。苗得園等(2001)建立了由單抗介導(dǎo)的檢測PRV的單抗夾心LAB一ELISA方法，結(jié)果表明，該方法不與其他常見病原體產(chǎn)生交叉反應(yīng)，病毒的最低檢出含量為8.9μg/ml。檢測時最佳采樣部位是豬腦及扁桃體。對人工感染兔、自然感染豬以及臨床可疑病豬的檢出率分別為75%、75% 及72.7%。本方法將特異性單抗和生物素一親和素系統(tǒng)引入傳統(tǒng)的ELISA中，是一種具有良好特異性及較好敏感性的診斷方法。

4.雙抗夾心ELISA。雙抗體夾心E LISA是PR臨床診斷和進出口檢疫的一種簡便而可靠的方法。祁小樂等（2004）利用所制備的兔抗PRV IgG和McAb建立的單克隆抗體雙夾心法，最低病毒檢出量為200μg/ml，與動物實驗、病毒分離和中和試驗符合率較高。婁高明等利用雙抗體夾心ELISA法對人工感染兔和自然感染豬的組織臟器進行檢測，抗體包被量為5μg/孔，酶標(biāo)抗體工作濃度為1∶200，結(jié)果發(fā)現(xiàn)扁桃體、腦和肺的檢出率最高，其次為心、肝、脾、腎等組織。與VI和電鏡比較，三種方法PRV的檢出率在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異。

（三）免疫膠體金診斷技術(shù)

膠體金免疫層析法是將免疫膠體金技術(shù)與層析分析技術(shù)有機結(jié)合起來建立的一種快速免疫學(xué)檢測技術(shù)。該技術(shù)最早用作電鏡的示蹤標(biāo)記物，并逐步應(yīng)用于傳染病檢測。白靜等在國內(nèi)首次研發(fā)的用于豬PRV gE抗體檢測的免疫層析試紙條，無需任何設(shè)備20 min內(nèi)可檢測抗體效價，該試紙條具有快速、簡便、靈敏、特異性好等特點，非常適用于基層實驗室和養(yǎng)殖戶。廖文軍等以純化的抗人紅細(xì)胞單鏈抗體(SeFv)-PRV gE蛋白雙功能融合蛋白為診斷抗原和膠體金標(biāo)記物，以羊抗豬IgG包被硝酸纖維膜作為質(zhì)控帶，制作檢測PRV gE抗體的雙抗原膠體金試紙條。試紙條在室溫保存6個月，其特異性和敏感性沒有明顯變化；與美國IDEXX和法國LSI gE—ELISA抗體檢測診斷試劑盒檢測結(jié)果比較，1 164份豬血清的符合率均為90.55%。制備的膠體金試紙條具有操作簡便、敏感性和特異性較高的特點，可用于PRV野毒感染的快速篩查。

四、病毒RNA診斷技術(shù)

（一）核酸雜交技術(shù)

核酸雜交技術(shù)是一種分子水平的檢測技術(shù)，是利用堿基互補原理檢測目的核酸片段具有敏感性、特異性強等特點，其最重要的一環(huán)就是特異性探針標(biāo)記，目前常用的標(biāo)記物有同位素、生物素及地高辛等。Rirtle等首次使用核酸探針技術(shù)鑒定了野外分離的PRV，從而獲得了流行病學(xué)的研究資料。國內(nèi)也存在利用探針檢測技術(shù)的研究，采用32P探針標(biāo)記PRV全基因組和重組質(zhì)粒應(yīng)用斑點雜交技術(shù)，從而獲取培養(yǎng)物中的PRV存在的信息，能檢測出10 pg的PRV-DNA，并具有較高的特異性。

1.PCR。PCR技術(shù)用于PRV診斷使診斷技術(shù)提高到基因水平，該技術(shù)是上世紀(jì)80年代建立起來的一項體外酶促擴增DNA新技術(shù)，可用于PRV DNA的擴增，也適用于檢測PRV潛伏感染豬。并且能快速鑒別PR疫苗毒與野毒。該方法具有簡便快捷、靈敏度高和特異性強的特點。

2.熒光PCR。近幾年來,有不少報道運用熒光定量PCR用于傳染病的診斷,表現(xiàn)出了良好的特異性和敏感性,顯示出了較好的應(yīng)用前景。實時熒光PCR與普通PCR相比，其特異性和靈敏度都要更高。萬超以偽狂犬病毒（PRV）保守的gE基因序列為參考，建立的一種快速定量檢測偽狂犬病毒的熒光定量PCR技術(shù)。該方法線形范圍為1.0×102～1.0×107拷貝/μL，靈敏度達(dá)102拷貝/μLDNA，比常規(guī)PCR高10倍。檢測的特異性明顯高于常規(guī)PCR，同時避免了常規(guī)PCR因電泳造成的污染。應(yīng)用該技術(shù)檢測66例豬組織或鼻咽拭子樣品，陽性檢出率為63.6%（42/66）。與病毒分離培養(yǎng)、常規(guī)PCR相比較結(jié)果顯示，該方法具有快速、靈敏、特異、重復(fù)性好和能定量檢測等優(yōu)點，該方法可用于豬場PRV感染的快速定量檢測和肉類食品進出口檢疫。

趙緒永等建立的建立檢測豬偽狂犬病毒（PRV）多重實時熒光定量PCR方法，具有高度特異性,與其他病原無明顯交叉反應(yīng);檢測靈敏度高,可檢出1.0×101拷貝/μL的陽性質(zhì)?；?TCID50/mL的病毒樣品。用多重Real-time PCR對42份臨床疑似病料進行檢測,其檢測結(jié)果與單重Real-time PCR結(jié)果完全一致。

鄭敏等建立的區(qū)分豬偽狂犬野毒株及基因缺失疫苗株的TaqMan—MGB熒光定量PCR檢測方法靈敏度可達(dá)2.23×10拷貝/μL，比常規(guī)PCR檢測方法高100倍；對30份疑似病料的TaqMan熒光定量PCR和普通PCR檢測陽性率分別為40%和33%，兩者符合率90%。該方法靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好，可同時檢測大量樣品，可適合于PRV的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

（二）限制性核酸內(nèi)切酶分析

用限制性核酸內(nèi)切酶對病毒DNA進行酶切，可以呈現(xiàn)不同的帶型，從而做出診斷。Lomniezi等對Bartha、Norden等疫苗毒株及Ka等野毒株DNA用Bam HI、EgIll、Kpn I酶切分析，發(fā)現(xiàn)弱毒株在Us區(qū)有缺失。Giekens等對NIA-3等野毒株和Rartha、BUK、Ercegovac、B-KAL、MK-25五個弱毒疫苗株DNA以BamH I酶切分析也證實疫苗株在US區(qū)有缺失，導(dǎo)致酶切圖譜改變。此法可用于分子流行病學(xué)調(diào)查。

（三）環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫擴增技術(shù)（RT-LAMP）

RT-LAMP技術(shù)是建立在基礎(chǔ)PCR基礎(chǔ)上的一種新型的核酸檢測的方法，具有簡便、快速高效、敏感性強等優(yōu)點。張莉等通過對偽狂犬病毒gE基因保守區(qū)域引物設(shè)計建立的RT-LAMP方法，最低檢測量可達(dá)到100個拷貝質(zhì)粒，敏感性比常規(guī)PCR方法高10倍。張侃等通過對PRV高度保守基因gB引物設(shè)計建立的RT-LAMP對PRV的檢測的敏感性比PCR方法高100倍，最低能夠檢測10個拷貝的目的基因。王樹芬等利用新的熒光染料羅丹明B衍生物作指示劑建立的可視化LAMP檢測PRV的方法，在63℃下恒溫反應(yīng)40 min即可得到肉眼可視的結(jié)果，可視化LAMP結(jié)果與電泳結(jié)果一致。該方法可以快速、直觀、準(zhǔn)確地檢測PRV,在診斷動物疾病上有廣闊的應(yīng)用前景，適合在基層養(yǎng)殖場應(yīng)用。

四、小結(jié)

目前PR病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷、分子生物學(xué)檢測方法的研究在廣度和深度上已有了較大進展，但各種方法各有優(yōu)缺點，每一種方法都難完全做到快速、簡便、靈敏、特異、經(jīng)濟和實用。因此對PRV感染的診斷必須建立在臨床初步診斷的基礎(chǔ)上，結(jié)合實驗室診斷手段，快速確定病原，然后根據(jù)判定結(jié)果，制定相對應(yīng)的免疫程序，達(dá)到快速防治PRV感染的目的。建立和完善用于我國的PR控制和消滅該病的診斷方法，是我國廣大獸醫(yī)科研工作者面臨的重大課題之一。

參考文獻(xiàn)（略）