梅毒的實驗室診斷方法及其應用進展

張麗，趙飛駿，張曉紅

(1 南華大學病原生物學研究所，湖南衡陽 421001；2 常德市第一人民醫(yī)院)

梅毒的實驗室診斷方法及其應用進展

張麗1,2，趙飛駿1，張曉紅1

(1 南華大學病原生物學研究所，湖南衡陽 421001；2 常德市第一人民醫(yī)院)

梅毒發(fā)病周期長，臨床表現(xiàn)復雜，漏診或誤診率較高，目前尚無對各期梅毒都有高敏感性和特異性的檢測方法。本文通過綜述梅毒螺旋體顯微鏡檢、梅毒螺旋體非特異性抗體試驗、梅毒螺旋體特異性抗體試驗及聚合酶鏈反應技術(shù)在各期梅毒檢測中的研究及應用進展，為臨床醫(yī)生提供參考意見。對于懷疑一期梅毒但血清學梅毒螺旋體特異性抗體試驗檢測陰性者，應取分泌物進行病原學檢測，或選用聚合酶鏈反應技術(shù)進一步檢測，或建議患者定期復查。對于二期、三期及隱性梅毒患者，應首選血清學梅毒螺旋體特異性抗體試驗檢測。

梅毒螺旋體；實驗室診斷方法

梅毒是一種慢性性傳播疾病，近年來發(fā)病率明顯上升；其病原菌是蒼白密螺旋體蒼白亞種，即梅毒螺旋體(Tp)。梅毒發(fā)病周期較長，可侵犯全身各組織器官，臨床表現(xiàn)復雜，各期梅毒患者都可伴有無病癥的潛伏期，目前臨床上并沒有對各期梅毒都有較高敏感性和特異性的檢測方法。本文對近年來實驗室常用的梅毒檢測方法及其在各期梅毒診斷中的應用作一綜述。

1 顯微鏡檢查

顯微鏡下可直接檢測到Tp，對一、二期梅毒的診斷有重要價值，具有快速、方便、易操作的特點，但常由于Tp含量低、皮損趨于好轉(zhuǎn)或已使用抗菌藥物等原因，易出現(xiàn)假陰性。Tp顯微鏡檢查主要包括鍍銀染色法、墨汁染色法、暗視野顯微鏡檢查法、 直接熒光免疫法(DFA)、多功能顯微診斷儀(MDI)檢查法和基于免疫組化的動聚焦顯微鏡檢測法(FFM)。鍍銀染色法、墨汁染色法和暗視野顯微鏡檢查法對操作人員的要求較高，同時多種非致病螺旋體會造成檢測結(jié)果的假陽性。DFA采用異硫氰酸熒光素標記抗Tp單克隆抗體，Tp陽性者可在熒光顯微鏡下發(fā)出黃綠色熒光，從而排除非Tp的干擾，檢測特異性高。MDI檢查法是一種綜合明暗視野、相差對比及偏振光的多種視頻顯微檢查技術(shù)，該方法于顯微鏡下放大40～15 000倍，可觀察到菌體細微結(jié)構(gòu)，同時借助相差光源增強觀察的立體感?；诿庖呓M化的FFM首先要對樣本進行免疫組化，再使用動聚焦顯微鏡進行觀察，通過移動顯微鏡的聚焦、三維立體掃描帶菌組織，可檢測到極微量的Tp，該方法對三期梅毒的檢出率高達87%[1]。MDI和FFM由于儀器比較昂貴，目前尚無法在臨床普及。

2 非特異性抗體試驗

Tp非特異性抗體試驗以卵磷脂、心磷脂及膽固醇作為抗原，檢查Tp感染者血清中的反應素(抗類脂抗原抗體)，對一期、二期梅毒的診斷價值較高，主要包括性病研究實驗室試驗(VDRL)、甲苯胺紅不加熱血清試驗(TRUST)、血清不加熱反應素試驗(USR)、快速血漿反應素(RPR) 環(huán)狀卡片試驗等。梅毒患者經(jīng)治療好轉(zhuǎn)后，RPR/TRUST滴度可降低或轉(zhuǎn)陰，故RPR/TRUST滴度可以用于判斷臨床療效。但由于機體在結(jié)核、瘧疾等其他疾病過程中也可產(chǎn)生抗類脂抗原抗體，會造成Tp非特異性抗體試驗結(jié)果的假陽性。腦脊液(CSF)中VDRL法檢測結(jié)果陽性被認為是診斷神經(jīng)梅毒的有力證據(jù)。研究報道，在CSF中，TRUST、RPR特異性與VDRL相似，而敏感性高于VDRL，可替代VDRL用于神經(jīng)梅毒的診斷[2]。試劑ITA3 RPR與RPR均可用于檢測血清中非特異性反應素的試驗，可結(jié)合免疫比濁法應用于自動生化分析儀，避免手工法檢測的人為誤差。Yukimasa等[3]研究報道，ITA3 RPR檢測梅毒的敏感性高于傳統(tǒng)RPR和VDRL，治療后的梅毒患者轉(zhuǎn)陰更快。

3 特異性抗體試驗

Tp特異性抗體試驗是以Tp全菌株或其成分作為抗原，檢測患者血清中有無特異性Tp抗體IgG或IgM，檢測特異性和敏感性均較高。Tp IgG檢測可用于診斷各期梅毒，但對早期梅毒檢出率不高，由于Tp IgG可終身攜帶，故不能作為治愈指標。Tp IgM檢測可用于先天梅毒、早期梅毒和神經(jīng)梅毒的診斷。大分子量Tp IgM不能通過胎盤，因此梅毒孕母的胎兒出生時或出生后不久檢測Tp IgM是診斷先天梅毒的重要手段。因為機體感染梅毒后首先產(chǎn)生的抗體是IgM，故梅毒感染早期Tp IgG檢測還是陰性時即可出現(xiàn)Tp IgM陽性。Bosshard[4]研究發(fā)現(xiàn)，部分Tp明膠顆粒凝集試驗(TPPA)陰性的早期梅毒患者，采用ELISA法檢測血清Tp IgM可呈陽性；由于梅毒特異性IgM相對分子量大，不能通過血腦屏障，因此CSF中出現(xiàn)Tp IgM是診斷神經(jīng)梅毒的有力證據(jù)。現(xiàn)常用的Tp特異性抗體試驗主要有梅毒全株抗原檢測特異性抗體試驗和梅毒重組抗原檢測特異性抗體試驗。

3.1 梅毒全株抗原檢測特異性抗體試驗 梅毒全株抗原檢測特異性抗體試驗中，熒光Tp抗體吸收試驗(FTA-ABS)、Tp血凝集試驗(TPHA)、Tp明膠顆粒凝集試驗(TPPA)均以Tp全菌株Nichols株作為抗原，檢測血清中Tp特異性抗體。FTA-ABS是一種Tp特異性抗體間接免疫熒光法，其對一、二、三期梅毒的敏感性分別為80%、99%～100%、95%～100%，特異性為92%[5]。Lin等[6]研究顯示，F(xiàn)TA-ABS-IgM檢測早期梅毒的敏感性高于TPPA-IgM。TPHA用羊紅細胞作為抗原載體，TPPA則用明膠顆粒作為抗原載體， 后者可避免前者血球自凝造成的漏診，因此敏感性和特異性均較高。研究報道，TPPA診斷梅毒的特異性為95%～100%，診斷一期、二期及隱性梅毒的敏感性分別為88%、100%、100%[7]。

3.2 梅毒重組抗原檢測特異性抗體試驗 目前，血清學診斷常用梅毒抗原有TpN15、TpN17、TpN47、TmpA。多種抗原融合可提高檢測的敏感性和特異性，常用的嵌合基因有TpN15-47、TpN15-17、TpN17-47、TpN15-47-17、TpN15-TmpA、TpN15-47-TmpA、TpN15-47-17-TmpA，陸續(xù)新發(fā)現(xiàn)的可用于梅毒診斷的抗原有TpF1、Tp0971、Tp0463、Tp0319、TpGpd、Tp0136 、Tp0821、Tp0319、Tp0663。楊斌等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Tp47、Tp15和Tp45在各期梅毒中都有較強的表達，可用于梅毒篩查，其中在各期表達有明顯差異的Tp41、Tp37和Tp33可考慮作為臨床分期觀察指標。米希婷等[9]研究顯示，Tp17抗體在血清中出現(xiàn)較早，可用于一、二期梅毒的診斷；Tp15抗體在二期梅毒患者血清中的陽性率較一期梅毒高。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、化學發(fā)光免疫分析(CLIA)、免疫印跡試驗(WB)、免疫膠體金試驗(GICA)、時間分辨熒光免疫測定法(TRFIA)、生物芯片技術(shù)、壓電免疫傳感器法和懸浮芯片技術(shù)均以梅毒重組抗原檢測血清中特異性梅毒抗體。

3.2.1 ELISA TP-ELISA采用基因重組表達的Tp特異性抗原包被在微孔板上，以辣根過氧化物酶標記，用雙抗原夾心法測定患者標本中特異性梅毒抗體。張學杰等[10]采用上海實業(yè)科華生物工程有限公司提供的TP-ELISA試劑，檢測早期潛伏、一期、二期、三期梅毒陽性率分別為83.3%、100.0%、100.0%、100.0%，總陽性率為96.8%。該方法成本低廉，可實現(xiàn)儀器化檢測，是臨床大批量標本檢測的理想方法，但受標本中一些類過氧化物酶物質(zhì)的影響，會造成檢測結(jié)果的假陽性。捕獲TP-ELISA-IgM法以抗人IgM抗體(抗人u鏈)作為固相抗體，當加入血清標本時，其中的IgM抗體即可被固相抗體捕獲，加入酶標記的特異性TP抗原后可以顯色。該方法可排除IgG的干擾，提高IgM檢測的敏感性和特異性。Nie等[11]報道了一種新的梅毒ELISA診斷方法，即電漿ELISA法，其測量范圍為1～10 ng/mL，檢出臨界值為0.98 pg/mL，檢測敏感性是傳統(tǒng)ELISA法的1 000倍。

3.2.2 CLIA TP-CLIA以Tp特異性蛋白制備成固相包被抗原，以辣根過氧化酶標記的Tp特異性蛋白作為檢測抗原，與樣品中的Tp抗體形成雙抗原夾心復合物，加入化學發(fā)光底物后測定其發(fā)光強度，即可判斷樣品中是否含有Tp特異性抗體。該方法分辨率較ELISA法高，且不易受血漿中其他物質(zhì)的干擾。Liu等[12]報道，CLIA法的特異性為99.70%，敏感性為99.00%，既可作為篩選試驗，又可作為診斷試驗。

3.2.3 WB WB先將電泳分離的特異性抗原轉(zhuǎn)移至固相支持物，然后用特異性抗體作為探針檢測靶物質(zhì)，具有凝膠電泳技術(shù)的高分辨率和固相免疫檢測高特異性、高敏感性等特點。Novikov等[13]報道WB法對早期梅毒、二期梅毒、神經(jīng)梅毒的檢出率均為100%。另有研究發(fā)現(xiàn)，在WB檢測中，梅毒早期TpN47抗原對應的抗體區(qū)帶即可出現(xiàn)，可作為早期梅毒的診斷指標，TpN15和TpN17抗原對應的抗體則有望作為療效觀察指標[14]。

3.2.4 GICT GICT是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術(shù)。TP-GICT采用純化的Tp重組抗原，以膠體金作為指示標記，以雙抗原夾心法快速檢測血清中Tp特異性抗體。其優(yōu)點為操作簡便，結(jié)果出現(xiàn)快、易于判讀，價格低廉，可用于梅毒快速篩查。Yin等[15]收集來自中國和尼日利亞的1 514例份血清樣本，用GICT技術(shù)制成的梅毒快速診斷檢測試劑進行檢測，診斷敏感性達98.3%～99.0%，特異性達97.2%～99.6%。

3.2.5 TRFIA TRFIA是用鑭系元素標記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點，用時間分辨技術(shù)測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數(shù)進行信號分辨；該方法可排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析敏感性。TP-TRFIA應用鑭系元素上金屬離子及其贅合物作為示蹤物代替酶，標記螺旋體特異性抗原，待抗原抗體復合物形成后，加入增強液，后引入信號放大體系，用時間分辨熒光儀測定終產(chǎn)物的熒光強度，根據(jù)相對熒光比值確定待測物濃度。Talha等[16]研究發(fā)現(xiàn)，TP-TRFIA特異性高于TP-ELISA。

3.2.6 生物芯片技術(shù) 生物芯片技術(shù)是通過縮微技術(shù)，將大量探針分子固定于硅芯片或玻璃芯片等支持物上，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、基因及其他生物組分的準確、快速、大信息量檢測。Tp生物芯片技術(shù)將多種Tp特異性蛋白或基因探針集成到固化支持物上，制成芯片，檢測患者標本中特異性梅毒抗體或基因片段。該方法的優(yōu)點是高通量，微型化，試劑用量少，標本體積小；缺點是生物芯片的制備成本高，檢測系統(tǒng)昂貴。Huang等[17]用梅毒特異性蛋白探針TpN15-17-47涂布生物芯片，檢測286例梅毒患者的血清樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與 TPPA方法的一致率達到97.9%。

3.2.7 壓電免疫傳感器法 壓電免疫傳感器是一種把特異性免疫反應和高靈敏壓電質(zhì)量傳感結(jié)合在一起的免疫檢測方法，具有檢測快速、檢出臨界值低、敏感性高、成本低廉、操作簡單等優(yōu)點，特別適用于野戰(zhàn)條件下獻血者的快速篩查。單桂秋等[18]將梅毒重組抗原吸附、固定到鍍金石英晶體表面，運用壓電免疫傳感陣列檢測技術(shù)快速檢測梅毒特異性抗體。與ELISA和TPPA作比對，一致率分別為90%和83%。

3.2.8 懸浮芯片技術(shù) 懸浮芯片技術(shù)利用帶編碼的微球體作為載體，以流式細胞儀作為檢測平臺，對核酸和蛋白質(zhì)等生物分子進行大規(guī)模檢測，具有高通量、多樣本、多指標同時檢測的優(yōu)點，且所需樣本量小，可自動化操作。陳峰等[19]分別將懸浮芯片技術(shù)與ELISA技術(shù)用于Tp檢測，發(fā)現(xiàn)二者的一致率較好，前者檢測精確度優(yōu)于后者。

4 聚合酶鏈反應(PCR)技術(shù)

梅毒PCR技術(shù)是一種體外擴增特異性DNA的方法，對早期皮損標本檢測敏感性高，但假陽性率較高、試劑成本高、實驗室條件要求高，目前只能作為血清學方法的補充。邱偉等[20]運用PCR技術(shù)擴增目的基因Tp polA，檢測358例疑似初期梅毒患者及66例二期梅毒患者的肛門或生殖器潰瘍處拭子標本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與TPPA檢測結(jié)果對比，PCR技術(shù)適用于初期梅毒診斷，但是對于二期梅毒的診斷價值不及TPPA。

現(xiàn)階段梅毒PCR診斷常用的靶基因有Tp47和polA，其PCR檢測技術(shù)主要有常規(guī)PCR、巢式PCR、熒光原位雜交技術(shù)和實時熒光定量PCR。常規(guī)PCR利用已知的待擴增目的基因片段的序列，設計一對相應的引物，以待檢標本中的TpDNA為模板，如標本中存在Tp，則可擴增出目的基因。巢式PCR通過兩輪PCR反應，使用兩套引物擴增特異性DNA片斷，其敏感性是常規(guī)PCR的40倍。梅毒熒光原位雜交技術(shù)以熒光基團標記的探針與Tp單鏈核酸雜交，通過熒光檢測對Tp進行定性或定量分析。Petrich等[21]以熒光基團標記的探針TpALL(5′-TAGGCTAGTGACTTCGGGTATCTCC-3′)與Tp-16S rRNA雜交，經(jīng)過熒光檢測4例(其中2例HIV陽性)組織病理檢查均陰性的梅毒患者，發(fā)現(xiàn)結(jié)果為陽性，說明其敏感性高于組織病理檢查。實時熒光定量PCR是在普通PCR體系中加入一段與目的擴增序列互補的Taqman探針，PCR反應中每擴增出一條產(chǎn)物就會切下一條探針，使報告基團的熒光增加一分，其檢測Tp的敏感性約為傳統(tǒng)PCR的250倍。

綜上所述，血清學檢測是梅毒實驗室診斷的主要方法，國內(nèi)多數(shù)醫(yī)院采用敏感性、特異性高，可儀器批量檢測，價位也不高的ELISA法進行初篩；采用梅毒特異性試驗TPPA進行確診，并配以簡單、成本低廉的梅毒非特異性試驗，如RPR法、TRUST法進行梅毒療效觀察、復發(fā)或再感染判斷。但各期梅毒血清學反應有差異，應有針對性地選擇實驗室檢測方法。懷疑一期梅毒，但血清學檢測陰性者，應取分泌物進行病原學檢測，或選用PCR法進一步檢測，或建議患者定期復查。二期、三期、隱性梅毒者，首選血清學檢測。Tp IgM抗體及PCR檢測對早期梅毒、神經(jīng)梅毒、先天梅毒、復發(fā)梅毒的診斷及療效判斷有獨特優(yōu)勢。同時，開發(fā)新的Tp蛋白重組診斷抗原，結(jié)合新的可增強檢測敏感性的技術(shù)方法，找到一些特異性更高、敏感性更好、快速、簡便、低成本的檢測方法，是目前Tp實驗室檢測的發(fā)展趨勢。

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國家自然科學基金資助項目(81373230、81301470)；廣東省公益研究與能力建設專項資金項目(2014A020212036)；特殊病原體防控湖南省重點實驗室資助項目(湘科計字[2014]5號)。

趙飛駿(E-mail: hengyangzhfj@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.041

R759.1

A

1002-266X(2016)16-0106-04

2015-10-20)