強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血淋巴細(xì)胞及血清PD-1、HLA-B27水平變化

宋紅林，孟保福，李艷霞，韓晶，王營偉

(安陽市人民醫(yī)院，河南安陽 455000)

強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血淋巴細(xì)胞及血清PD-1、HLA-B27水平變化

宋紅林，孟保福，李艷霞，韓晶，王營偉

(安陽市人民醫(yī)院，河南安陽 455000)

目的 觀察強(qiáng)直性脊柱炎(AS)患者外周血淋巴細(xì)胞及血清程序性死亡受體1(PD-1)、人類白細(xì)胞抗原B27(HLA-B27)水平變化，并探討其意義。方法 選擇AS患者40例(觀察組)、同期健康體檢者40例(對照組)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組外周血淋巴細(xì)胞膜型PD-1和HLA-B27表達(dá)率，ELISA法檢測血清可溶性PD-1和HLA-B27水平。取觀察組淋巴細(xì)胞，加入或不加入終濃度為5 μg/mL可溶性PD-1配體PD-L1，進(jìn)行微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)(MLCT)，對淋巴細(xì)胞死亡率進(jìn)行評分。結(jié)果 觀察組和對照組外周血淋巴細(xì)胞膜型PD-1表達(dá)率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，觀察組外周血淋巴細(xì)胞膜型HLA-B27表達(dá)率及血清可溶性PD-1、HLA-B27水平均高于對照組(P均<0.05)。觀察組加入和不加入可溶性PD-L1的淋巴細(xì)胞MLCT評分分別為(2.63±1.24)、(3.05±1.00)分，評分比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論 AS患者外周血淋巴細(xì)胞膜型PD-1表達(dá)無明顯變化，血清可溶性PD-1、HLA-B27水平均明顯升高，其發(fā)病可能與PD-1/PD-L通路介導(dǎo)的免疫抑制信號(hào)有關(guān)。

強(qiáng)直性脊柱炎；程序性死亡受體1；人類白細(xì)胞抗原B27

強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是一種慢性進(jìn)行性自身免疫炎癥性疾病，主要累及脊椎等中軸關(guān)節(jié)和肌腱韌帶骨附著點(diǎn)，致殘率高[1]。AS發(fā)病原因不明，除與人類白細(xì)胞抗原B27(HLA-B27)高度表達(dá)有關(guān)以外，免疫共刺激分子的參與，尤其是程序性死亡受體1(PD-1)等免疫負(fù)性分子失調(diào)是其發(fā)病的關(guān)鍵因素[2]。PD-1分為膜型和可溶性兩種形式，其在B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞上激活后表達(dá)會(huì)增加，與兩個(gè)配體PD-L1和PD-L2結(jié)合后，介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)通路中的負(fù)性調(diào)節(jié)，協(xié)同發(fā)揮共刺激分子作用，可能與AS病情進(jìn)展相關(guān)[3]。本研究觀察AS患者外周血淋巴細(xì)胞膜型PD-1、HLA-B27及血清可溶性PD-1、HLA-B27的水平變化，探討其與AS發(fā)病的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年8月～2015年7月我院收治的AS患者40例(觀察組)，男24例、女16例，年齡20～60歲、平均36歲，病程12～50個(gè)月、平均28個(gè)月。選擇同期健康體檢者40例(對照組)，男22例、女18例，年齡18～65歲、平均39歲。AS診斷均符合1984年美國紐約修定標(biāo)準(zhǔn)[4]，排除合并其他自身免疫性疾病及嚴(yán)重心、肝、腎臟疾病者[5]。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2 外周血淋巴細(xì)胞膜型PD-1及HLA-B27表達(dá)檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。采集兩組空腹靜脈血6 mL，其中3 mL置于不加抗凝劑的采血管中，凝集30 min；3 500 r/min離心5 min，收集血清，避免溶血和高脂血標(biāo)本，分裝后置于-20 ℃冰箱保存待測。另外3 mL置于肝素抗凝采血管內(nèi)，F(xiàn)icoll密度梯度離心法收集外周血淋巴細(xì)胞，在5×105/mL淋巴細(xì)胞懸液中加入PE標(biāo)記鼠抗人HLA-B27單抗1 μL；4 ℃結(jié)合30 min；PBS洗滌后，再加入FITC標(biāo)記鼠抗人PD-1單抗1 μL，4 ℃結(jié)合30 min；PBS再次洗滌后，采用直接熒光標(biāo)記法檢測膜型PD-1及HLA-B27表達(dá)率。采用Pearson積矩法分析兩組外周血淋巴細(xì)胞膜型PD-1和HLA-B27表達(dá)率的相關(guān)性。

1.3 血清可溶性PD-1及HLA-B27水平檢測 采用ELISA法。取出1.2中冰箱保存待測的血清標(biāo)本，室溫融化，避免反復(fù)凍融。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，分別檢測兩組血清可溶性PD-1和HLA-B27水平。顯色后雙波長比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品比色數(shù)值和對應(yīng)濃度繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出標(biāo)本水平。采用Pearson積矩法分析兩組血清可溶性PD-1與HLA-B27水平的相關(guān)性。

1.4 可溶性PD-L1對觀察組淋巴細(xì)胞死亡情況的影響 采用微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)(MLCT)。取觀察組淋巴細(xì)胞，加入或不加入終濃度為5 μg/mL可溶性PD-L1，每例樣本均設(shè)置4個(gè)平行復(fù)孔、1個(gè)陰性對照孔和1個(gè)陽性對照孔。將淋巴細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/mL，用微量連續(xù)加樣器將細(xì)胞懸液加入到抗血清板上，每孔1 μL，室溫孵育30 min。加入兔補(bǔ)體5 μL，室溫孵育1 h；加入5%伊紅2 μL，室溫反應(yīng)2 min；加入36%中性甲醛固定，4 ℃培養(yǎng)過夜。次日于倒置顯微鏡下觀察，依據(jù)血清板對淋巴細(xì)胞死亡情況進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)陰性對照孔內(nèi)淋巴細(xì)胞沒有死亡，并且陽性對照孔內(nèi)淋巴細(xì)胞全部死亡時(shí)，淋巴細(xì)胞死亡率>50%記1分，≤50%記0分，4個(gè)平行復(fù)孔得分相加，為該例樣本最終得分，最高4分、最低0分。如果陰性孔內(nèi)有死亡淋巴細(xì)胞或陽性孔內(nèi)有成活淋巴細(xì)胞，則重復(fù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血淋巴細(xì)胞膜型PD-1、HLA-B27表達(dá)率比較及關(guān)系分析 觀察組和對照組外周血淋巴細(xì)胞膜型PD-1表達(dá)率分別為7.08%±2.51%、7.29%±2.62%，兩組比較P>0.05；觀察組和對照組外周血淋巴細(xì)胞膜型HLA-B27表達(dá)率分別為64.70%±24.86%、10.47%±3.73%，兩組比較P<0.05。觀察組和對照組外周血淋巴細(xì)胞膜型PD-1、HLA-B27表達(dá)率均無明顯相關(guān)性(r分別為0.25、-0.22，P均<0.01)。

2.2 兩組血清可溶性PD-1、HLA-B27水平比較及關(guān)系分析 觀察組和對照組血清可溶性PD-1水平分別為(71.62±27.07)、(52.28±18.82)ng/mL，兩組比較P<0.05；觀察組和對照組血清可溶性HLA-B27水平分別為(58.90±16.83)、(19.13±6.95)U/mL，兩組比較P<0.05。觀察組血清可溶性PD-1與HLA-B27水平呈正相關(guān)(r=0.52，P<0.05)，對照組血清可溶性PD-1、HLA-B27水平無明顯相關(guān)性(r=-0.04，P<0.01)。

2.3 可溶性PD-L1對觀察組淋巴細(xì)胞MLCT評分的影響 觀察組加入和不加入可溶性PD-L1的淋巴細(xì)胞MLCT評分分別為(2.63±1.24)、(3.05±1.00)分，評分比較P<0.05。

3 討論

AS患者體內(nèi)存在多種協(xié)同刺激分子失衡，造成免疫調(diào)節(jié)紊亂，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生、發(fā)展[6]。臨床生物標(biāo)志物HLA-B27和AS的發(fā)病有密切聯(lián)系，我國AS患者HLA-B27的陽性率為90%左右[7，8]。本研究結(jié)果顯示，觀察組膜型HLA-B27表達(dá)率明顯高于對照組，但是與文獻(xiàn)報(bào)道的90%左右陽性率有一定差別。分析原因，可能由于本研究中樣本量較少，收集病例時(shí)間較長，不能排除已經(jīng)進(jìn)行治療的AS患者，因此對HLA-B27的檢測結(jié)果造成了一定影響。研究顯示，HLA-B27的表達(dá)對負(fù)性分子PD-1影響不大[9]。

HLA-B27高表達(dá)同時(shí)，可能也有其他免疫分子的變化，一般表現(xiàn)為免疫功能亢進(jìn)，形成對骨骼關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)。PD-1/PD-L是B7/CD28家族中一對重要的協(xié)同刺激分子，PD-1是1992年發(fā)現(xiàn)的CD28超家族成員之一，由2號(hào)染色體上的PDCD1基因編碼。PD-1主要在活化的T、B和NK淋巴細(xì)胞上呈誘導(dǎo)性表達(dá)，隨細(xì)胞活化逐步上調(diào)表達(dá)，與其配體PD-L(PD-L1和PD-L2)相互作用，提供T淋巴細(xì)胞活化抑制信號(hào)。因此，PD-1/PD-L途徑對T淋巴細(xì)胞在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮適當(dāng)而有效的調(diào)節(jié)具有重要意義，與自身免疫、腫瘤、感染等疾病的發(fā)生也密切相關(guān)[10，11]。

除膜型PD-1外，在人外周血中還存在可溶性PD-1，而且其水平與自身免疫病的發(fā)生密切相關(guān)。本研究觀察組可溶性PD-1水平明顯高于對照組，而兩組膜型PD-1表達(dá)則沒有明顯差異。這些升高的可溶性PD-1可能來源于膜型分子，機(jī)體內(nèi)一些細(xì)胞膜表面的協(xié)同刺激分子可從細(xì)胞表面裂解，并脫落成為可溶形式。另外，PD-1基因也存在多種天然的mRNA剪切體，其中缺失編碼跨膜區(qū)外顯子的剪切體，最終翻譯為可溶性PD-1蛋白。由于可溶性PD-1的增多，過度結(jié)合配體PD-L，使得配體不能充分與膜型PD-1結(jié)合，從而干擾正常的免疫抑制；免疫細(xì)胞始終處于活化狀態(tài)，持續(xù)釋放免疫激活信號(hào)，最終發(fā)生免疫炎癥反應(yīng)[12]。

MLCT過程中，在分離出來的免疫細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境內(nèi)，加入抑制信號(hào)分子PD-L1，可以體外模擬免疫抑制信號(hào)[13]。本研究觀察組加入可溶性PD-L1后淋巴細(xì)胞MLCT評分低于不加入可溶性PD-L1的淋巴細(xì)胞，說明可溶性PD-L1可減少淋巴細(xì)胞死亡。分析原因，可能是膜型PD-1的胞質(zhì)區(qū)含有一個(gè)免疫受體酪氨酸抑制基序和一個(gè)免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(ITSM)，膜型PD-1結(jié)合了足夠配基PD-L1，PD-1/PD-L1相互作用后觸發(fā)ITSM募集信號(hào)分子SHP-2，引發(fā)抑制信號(hào)的產(chǎn)生，致使效應(yīng)T細(xì)胞失去作用，導(dǎo)致補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞穿孔效應(yīng)缺乏必要的應(yīng)答部位[14]。本研究AS患者血清可溶性PD-1與HLA-B27水平呈顯著正相關(guān)，提示AS患者血清可溶性PD-1與HLA-B27之間能夠相互調(diào)節(jié)，從而影響疾病的發(fā)生和發(fā)展[15]。

綜上所述，AS患者外周血淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)無明顯變化，血清可溶性PD-1、HLA-B27水平均明顯升高，其發(fā)病可能與PD-1/PD-L通路介導(dǎo)的免疫抑制信號(hào)有關(guān)。

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