絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者血漿SOST表達(dá)變化及其與基因甲基化的關(guān)系

時(shí)宇博，朱福良，李立軍，王云國，宗強(qiáng)，倪東馗

(天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津300211)

·臨床研究·

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者血漿SOST表達(dá)變化及其與基因甲基化的關(guān)系

時(shí)宇博，朱福良，李立軍，王云國，宗強(qiáng)，倪東馗

(天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津300211)

目的 觀察絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者血漿SOST基因表達(dá)變化，并探討其與基因甲基化的關(guān)系。方法 選擇絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥者60例(觀察組)，絕經(jīng)后無骨質(zhì)疏松癥患者60例(對照組)。采集兩組空腹外周血，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測血漿SOST mRNA相對表達(dá)量，甲基化特異性-PCR法檢測SOST基因甲基化情況，分析SOST mRNA表達(dá)與其基因甲基化的關(guān)系。結(jié)果 觀察組及對照組SOST mRNA相對表達(dá)量分別為(6.126±0.304)×10-5、(1.936±0.358)×10-5，兩組比較P<0.05；SOST基因甲基化陽性率分別為66.67%(40/60)、83.33%(50/60)，兩組比較P<0.05。觀察組SOST基因甲基化陽性及陰性者mRNA相對表達(dá)量分別為(1.725±0.046)×10-5、(4.253±0.039)×10-5，SOST基因甲基化陽性陽性率與其mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.996，P<0.01)。對照組SOST基因甲基化陽性及陰性者mRNA相對表達(dá)量分別為(1.362±0.091)×10-5、(5.251±0.042)×10-5，SOST基因甲基化率與其mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.985，P<0.01)。結(jié)論 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者血漿SOST mRNA表達(dá)升高，可能與其基因低甲基化有關(guān)。

骨質(zhì)疏松癥；SOST基因；甲基化；絕經(jīng)；女性

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨的脆性增加，易于發(fā)生骨折的全身性骨骼疾病。骨質(zhì)疏松癥是一種復(fù)雜的多基因遺傳病,其遺傳率為60%～80%[1]。SOST基因位于人類基因組的17q12-21,主要在骨細(xì)胞中表達(dá),含有兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子,編碼硬化蛋白[2]。硬化蛋白能夠抑制骨分化和形成過程中的Wnt信號(hào)途徑，抑制硬化蛋白的表達(dá)能夠促進(jìn)骨形成[3，4]。本研究觀察絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者血漿SOST mRNA表達(dá)變化，并探討其與基因甲基化的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年5～8月我院收治的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥者60例(觀察組)，年齡(57±2)歲；絕經(jīng)后無骨質(zhì)疏松癥患者60例(對照組)，年齡(56±1)歲。骨質(zhì)疏松癥參照WHO推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)、甲狀旁腺功能亢進(jìn)等影響骨代謝的內(nèi)分泌疾病者；②合并肝腎功能異常、胃炎、腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、派杰氏病或骨腫瘤等惡性腫瘤者；③半年內(nèi)曾使用過激素或其他影響骨代謝的藥物者；④1年內(nèi)發(fā)生骨折等導(dǎo)致肢體運(yùn)動(dòng)功能受限者。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，且患者知情同意。

1.2 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.2.1 血漿SOST mRNA表達(dá) 采用實(shí)時(shí)定量PCR法。兩組空腹12 h以上，于次日清晨8～9點(diǎn)取靜脈血2 mL，均采用EDTA抗凝。采用TRIzol一步法快速提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)采用Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG試劑盒，使用ABI 7500 Sequence Detector儀器及分析系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增和分析。反應(yīng)體系包括cDNA、Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG及上游引物、下游引物。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)檢測兩次。SOST mRNA相對表達(dá)量以2-ΔΔCT表示。

1.2.2 SOST基因甲基化情況 按照DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取DNA后進(jìn)行定量，根據(jù)甲基化試劑盒說明書對所提取的DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾和純化。采用甲基化特異性-PCR法檢測SOST基因甲基化情況，按試劑盒說明書操作。所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成，反應(yīng)體系：亞硫酸鹽處理的DNA，10×PCR buffer，上下游引物，2.5 mmol/L dNTP，Taq DNA Polymerase，加入ddH2O至總體積為25 μL。甲基化和非甲基化反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min，共45個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 兩組血漿SOST mRNA相對表達(dá)量比較 觀察組SOST mRNA相對表達(dá)量為(6.126±0.304)×10-5，對照組為(1.936±0.358)×10-5，兩組比較P<0.05。

2.2 兩組SOST基因甲基化情況比較 觀察組SOST基因甲基化陽性40例、陰性20例，甲基化陽性率為66.67%；對照組SOST基因甲基化陽性50例、陰性10例，甲基化陽性率為83.33%；兩組比較P<0.05。

2.3 SOST mRNA表達(dá)與甲基化的關(guān)系 觀察組SOST基因甲基化陽性者mRNA相對表達(dá)量為(1.725±0.046)×10-5，陰性者為(4.253±0.039)×10-5，SOST基因甲基化陽性率與其mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.996，P<0.01)。對照組SOST基因甲基化陽性者mRNA相對表達(dá)量為(1.362±0.091)×10-5，陰性者為(5.251±0.042)×10-5，SOST基因甲基化陽性率與其mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.985，P<0.01)。

3 討論

Loots等[5]研究顯示，骨肥大癥患者SOST基因下游35 kb處存在一個(gè)52 kb的缺失，表明SOST基因在成人骨骼中是必需的。Li等[6]以9～10周SOST基因敲除小鼠和野生型小鼠為研究對象，通過放射性技術(shù)檢測其骨折愈合程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因敲除更有利于胼胝體橋的形成，并增強(qiáng)骨和骨組織的形成。在治療骨質(zhì)疏松癥和相關(guān)的低密度骨骼疾病的研究中，SOST基因逐漸受到越來越多的關(guān)注[7～9]。

SOST基因的表達(dá)具有特異性，胚胎時(shí)期可以在多種組織中表達(dá)，成年人或鼠中只在骨細(xì)胞特異性表達(dá)，是調(diào)控成骨細(xì)胞功能的一個(gè)重要基因[10]。本研究結(jié)果顯示，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者血漿SOST mRNA相對表達(dá)量明顯高于無骨質(zhì)疏松癥者，但是其作用機(jī)制尚不清楚。骨質(zhì)疏松癥是一種與年齡有關(guān)的疾病，隨著年齡的增長，基因甲基化的模式會(huì)發(fā)生變化，因此推測基因甲基化可能有助于骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[11，12]。Delgado-Calle等[8]研究發(fā)現(xiàn)，SOST基因有兩個(gè)CpG富集區(qū),其中一個(gè)區(qū)域臨近啟動(dòng)區(qū)域外顯子1附近，在成骨細(xì)胞中的甲基化程度高于骨細(xì)胞。體外研究顯示，SOST基因CpG島的甲基化可阻礙蛋白結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)，脫甲基后基因表達(dá)顯著上調(diào),也提示基因表達(dá)在成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變過程中的作用[13]。

為探討SOST基因表達(dá)與其甲基化在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病中的作用，我們檢測了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和無骨質(zhì)疏松癥者血漿的SOST甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示前者的SOST甲基化陽性率明顯低于后者，與Reppe等[14]研究結(jié)論一致；相關(guān)性分析顯示，兩組SOST基因甲基化陽性率與其mRNA表達(dá)均呈顯著負(fù)相關(guān)，與Papathanasiou等[15]研究結(jié)論一致。提示SOST基因甲基化可引起其mRNA表達(dá)發(fā)生變化，直接或間接阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合，從而降低其轉(zhuǎn)錄水平，可能是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的機(jī)制之一。

綜上所述，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者血漿SOST mRNA表達(dá)升高，可能與其低甲基化有關(guān)，二者的相互作用在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義。本研究為揭示骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)，但是關(guān)于SOST基因甲基化如何調(diào)節(jié)其表達(dá)的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

[1] Suri P, Morgenroth DC, Hunter DJ. Epidemiology of osteoarthritis and associated comorbidities[J]. Pm R, 2012,4(5 Suppl):10-19.

[2] Delgado-Calle J, Riancho JA, Klein-Nulend J. Nitric oxide is involved in the down-regulation of SOST expression induced by mechanical loading[J]. Calcif Tissue Int, 2013,94(4):414-422.

[3] Bhadada SK, Rastogi A, Steenackers E, et al. Novel SOST gene mutation in a sclerosteosis patient and her parents[J]. Bone, 2013,52(2):707-710.

[4] Pascual-Carra MA. DNA methylation contributes to the regulation of sclerostin expression in human osteocytes[J]. J Bone Miner Res, 2014,27(8):372-381.

[5] Loots GG, Kneissel M, Keller H, et al. Genomic deletion of a long-range bone enhancer misregulates sclerostin in Van Buchem disease[J]. Genome Res, 2005,15(7):928-935.

[6] Li C, Ominsky MS, Tan HL, et al. Increased callus mass and enhanced strength during fracture healing in mice lacking the sclerostin gene[J]. Bone, 2011,49(6):1178-1185.

[7] Piters E, Culha C, Moester M, et al. First missense mutation in the SOST gene causing sclerosteosis by loss of sclerostin function[J]. Hum Mutat, 2010,31(7):1526-1543.

[8] Delgado-Calle J, Sanudo C, Bolado A, et al. DNA methylation contributes to the regulation of sclerostin expression in human osteocytes[J]. J Bone Miner Res, 2012,27(4):926-937.

[9] Lewiecki EM. Role of sclerostin in bone and cartilage and its potential as a therapeutic target in bone diseases[J]. Ther Adv Musculoskelet Dis, 2014,6(2):48-57.

[10] 姚琦,黃鵬,姜華,等.Sclerostin與骨質(zhì)疏松研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2011,51(40):98-101.

[11] Johnson VL, Hunter DJ. The epidemiology of osteoarthritis[J]. Best Pract Res Clin Rheumatol, 2014,28(1):5-15.

[12] Jeffries MA, Donica M, Baker LW, et al. Genome-wide DNA methylation study identifies significant epigenomic changes in osteoarthritic cartilage[J]. Arthritis Rheumatol, 2014,66(10):2804-2815.

[13] Delgado-Calle J, Arozamena J, Perez-Lopez J, et al. Role of BMPs in the regulation of sclerostin as revealed by an epigenetic modifier of human bone cells[J]. Mol Cell Endocrinol, 2013,369(1-2):27-34.

[14] Reppe S, Noer A, Grimholt RM, et al. Methylation of bone SOST, its mRNA, and serum sclerostin levels correlate strongly with fracture risk in postmenopausal women[J]. J Bone Miner Res, 2015,30(2):249-256.

[15] Papathanasiou I, Kostopoulou F, Malizos KN, et al. NDNA methylation regulates sclerostin (SOST) expression in osteoarthritic chondrocytes by bone morphogenetic protein 2 (BMP-2)induced changes in Smads binding affinity to the CpG region of SOST promoter[J]. Arthritis Res Ther, 2015(17):160.

倪東馗(E-mail： chenlyx126@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.011

R174.4

B

1002-266X(2016)16-0035-03

2015-09-16)