層流剪切應力對高脂環(huán)境下白細胞-內皮細胞黏附的影響及其機制

李燕玲，何小洪，張焰，鐘挺挺，3，董吁鋼，馬虹，鄭振聲

(1中山大學附屬第一醫(yī)院，廣州510080；2中山大學附屬第三醫(yī)院；3中山大學附屬第二醫(yī)院)

層流剪切應力對高脂環(huán)境下白細胞-內皮細胞黏附的影響及其機制

李燕玲1，2，何小洪1，張焰1，鐘挺挺1，3，董吁鋼1，馬虹1，鄭振聲1

(1中山大學附屬第一醫(yī)院，廣州510080；2中山大學附屬第三醫(yī)院；3中山大學附屬第二醫(yī)院)

目的 探討層流剪切應力對高脂環(huán)境下白細胞-內皮細胞黏附的影響及其機制。方法 以氧化型低密度脂蛋白造成高脂環(huán)境，誘導人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)損傷，分別以0、5、25 dyne/cm2層流剪切應力對損傷后的HUVECs干預4 h(分別記為0、5、25 dyne/cm2組)。采用人白血病淋巴瘤細胞株U937行白細胞-內皮細胞黏附試驗，計算每100個HUVECs上黏附的U937細胞數(shù)；采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察HUVECs細胞膜上的β1整合素抗體熒光信號強度，流式細胞術檢測β1整合素陽性率。結果 0 dyne/cm2組、5 dyne/cm2組和25 dyne/cm2組黏附的細胞數(shù)量依次降低(P均<0.05)，細胞膜上的β1整合素抗體熒光信號強度逐漸減弱，β1整合素陽性率分別為98.98%±0.36%、88.58%±3.34%、81.28%±5.19%；0 dyne/cm2組β1整合素陽性率明顯高于25 dyne/cm2組(P<0.05)，0 dyne/cm2組與5 dyne/cm2組比較、5 dyne/cm2組與25 dyne/cm2組比較均無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)。結論 在一定范圍內適當提高層流剪切應力能夠降低高脂環(huán)境下內皮細胞上黏附的白細胞數(shù)量，機制可能與降低內皮細胞膜β1整合素表達有關。

動脈粥樣硬化；層流剪切應力；內皮細胞；白細胞；β1整合素

內皮細胞活化是早期動脈粥樣硬化(AS)的重要表現(xiàn)，活化的內皮細胞表達選擇素、白細胞黏附因子、整合素以及趨化因子，導致白細胞黏附于內皮細胞層，并最終定植于血管壁[1，2]。白細胞與內皮細胞之間的黏附被認為是導致血管炎癥的重要原因，其機制尚不十分明確[3]。研究發(fā)現(xiàn)，動脈發(fā)生彎曲、分叉以及發(fā)出分支的地方是AS好發(fā)之處，也是剪切應力水平低下并易發(fā)生湍流之處[4]。內皮細胞所在的血流環(huán)境對其功能以及血管穩(wěn)態(tài)具有非常重要的影響[5]。一般認為，層流剪切應力決定血管內粥樣硬化的分布，但內皮細胞如何將層流剪切應力這種機械刺激轉化為生化信號尚不清楚。2012年5月～2015年6月，我們觀察了層流剪切應力對高脂環(huán)境下白細胞-內皮細胞黏附的影響，現(xiàn)分析結果并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)，人白血病淋巴瘤細胞株U937(中山大學實驗中心細胞庫)。人內皮細胞培養(yǎng)基、胰酶(0.25%胰酶+0.05% EDTA)、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL，廣州益元生物科技有限公司)，PE標記鼠抗人β1整合素抗體(上海玉博生物科技有限公司)，牛血清蛋白(美國Mpbio公司)。臺式離心機(Universal 32,德國Hettich公司)，平行板流動小室(美國GlycoTech公司)，激光掃描共聚焦顯微鏡(Fluoview FV 500-Ⅳ 81,日本Olympus公司)，流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)，倒置顯微鏡(Eclipse TS100,日本Nikon公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) ①HUVECs培養(yǎng)：參照Kartikasari等[6]的方法，從新鮮臍帶中提取HUVECs。從臍靜脈的一端置管，灌入0.2% Ⅱ型膠原酶原液，37 ℃反應15 min。將含有內皮細胞的消化液收集后離心，棄上清，使用含10% FBS的內皮細胞培養(yǎng)基重懸細胞，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。將培養(yǎng)后的細胞融合，使用胰酶進行消化并分種至培養(yǎng)皿中，當細胞生長至融合時即可用于試驗，用于試驗的細胞傳代不超過兩代。②U937細胞培養(yǎng)：按照懸浮細胞培養(yǎng)方法，采用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)U937細胞，2～3天進行換液。換液時將細胞懸液轉移至15 mL離心管，100 r/min離心5 min；棄上清，加入4 mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞懸液轉移至培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 OX-LDL誘導HUVECs損傷模型及體外層流剪切應力系統(tǒng)的建立 將OX-LDL溶于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，最終有效濃度調整為10 μg/mL。將層流室與灌有高濃度(10 μg/mL)OX-LDL培養(yǎng)基的管道系統(tǒng)連接起來，使用蠕動泵驅動管道中的培養(yǎng)基流動，31-005墊片(寬度為1.00 cm，厚度為0.010 inch)接入層流小室。將種有HUVECs的培養(yǎng)皿接入層流小室中，參照Kemeny等[7]的方法，使培養(yǎng)基流經層流小室分別產生0、5、25 dyne/cm2的層流切應力(分別記為0、5、25 dyne/cm2組)，并直接作用于HUVECs，作用時間為4 h。層流剪切應力= 6 μQ/wh2，μ為流體黏滯度，Q為液體流速(mL/s)，w為墊片寬度(cm)，h為墊片厚度(inch)。

1.4 相關指標觀察

1.4.1 層流剪切應力對白細胞-內皮細胞黏附的影響 參照McCracken等[8]的方法，改進后進行白細胞-內皮細胞黏附試驗。如1.3所述，在含有OX-LDL的培養(yǎng)基中，三組HUVECs分別經0、5、25 dyne/cm2的層流剪切應力干預4 h，將整個層流小室放于裝有錄影照相機的倒置顯微鏡載物臺上。將細胞濃度為5×105/mL的U937單細胞懸液置換上述含OX-LDL的培養(yǎng)基，調節(jié)泵度，使剪切應力為5 dyne/cm2。U937細胞在回路中隨灌流液流經層流小室，與HUVECs接觸5 min，用PBS將滯留在HUVECs表面而沒有黏附的U937細胞洗掉。20倍顯微鏡下任意選取10個視野進行拍照，計數(shù)每個視野黏附在HUVECs上的U937數(shù)目(M)以及該視野的HUVECs數(shù)目(N)。計算每100個內皮細胞上黏附的U937細胞數(shù)(K)，即K=100×M/N。每組進行3次試驗。

1.4.2 HUVECs細胞膜β1整合素表達 ①β1整合素抗體熒光信號強度：使用4%多聚甲醛固定上述干預后的三組HUVECs，1% FBS于37 ℃條件下封閉30 min。PE標記的鼠抗人β1整合素抗體(20 μL∶200 μL)溶液覆蓋HUVECs，4 ℃避光過夜。使用DAPI(1 μg/mL)對細胞核進行染色，采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察HUVECs細胞膜上的β1整合素抗體熒光信號強度。②β1整合素陽性率：采用流式細胞術。胰酶消化上述干預后的三組HUVECs，收集細胞并進行離心，棄上清。取PE標記的鼠抗人β1整合素抗體溶液重懸HUVECs，37 ℃避光孵育30 min，4%多聚甲醛固定。采用流式細胞儀分析結果，計算HUVECs細胞膜上的β1整合素陽性率。每組進行5次試驗。

2 結果

2.1 三組黏附細胞數(shù)量比較 白細胞-內皮細胞黏附試驗顯示，U937細胞大量黏附于OX-LDL作用后的HUVECs表面。0 dyne/cm2組、5 dyne/cm2組和25 dyne/cm2組黏附的U937細胞數(shù)量分別為(78.54±6.96)、(42.61±3.19)、(29.19±5.44)個，多組間比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；0 dyne/cm2組黏附的細胞數(shù)量明顯多于5 dyne/cm2組和25 dyne/cm2組，5 dyne/cm2組明顯多于25 dyne/cm2組(P均<0.05)。

2.2 三組β1整合素表達比較 激光共聚焦檢測結果顯示，0 dyne/cm2組、5 dyne/cm2組和25 dyne/cm2組HUVECs細胞膜上的β1整合素抗體熒光信號強度逐漸減弱，見插頁Ⅱ圖3。流式細胞術檢測結果顯示，0 dyne/cm2組、5 dyne/cm2組和25 dyne/cm2組β1整合素陽性率分別為98.98%±0.36%、88.58%±3.34%、81.28%±5.19%，0 dyne/cm2組β1整合素陽性率明顯高于25 dyne/cm2組(P<0.05)，0 dyne/cm2組與5 dyne/cm2組比較、5 dyne/cm2組與25 dyne/cm2組比較均無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)。

3 討論

粥樣硬化是脂質引起的血管慢性炎癥反應，最終會導致血管狹窄甚至閉塞，從而引起一系列的心血管事件。血液循環(huán)中白細胞黏附到內皮細胞層被認為是AS發(fā)生的最早期事件，血管內皮細胞活化后，血液中的白細胞黏附于內皮細胞，粥樣硬化病變開始形成。有研究從高脂血癥患者血液中分離出白細胞并進行體外試驗，發(fā)現(xiàn)這些白細胞更容易黏附于內皮細胞，且內皮細胞整合素及其他黏附分子表達均增加[9]。

在眾多的因素中，OX-LDL被認為是導致內皮細胞活化及其功能障礙的最主要因素，其具有促進白細胞聚集及其與內皮細胞黏附的作用。此外，局部動力學因素特別是層流剪切應力，可顯著影響AS的發(fā)病進程[10]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在AS的好發(fā)之處，其層流剪切應力水平較低[5]。在這些低剪切應力的地方，粥樣斑塊更容易形成并且更易破裂出血[11]，且在高脂環(huán)境下，脂質更容易聚集于血管壁，白細胞也更容易聚集，從而促進斑塊的發(fā)生及發(fā)展。相反，在層流剪切應力高的地方，促粥樣硬化基因表達下降，抗粥樣硬化基因表達增加，可對抗AS的形成[12]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，0 dyne/cm2組、5 dyne/cm2組和25 dyne/cm2組黏附的U937細胞數(shù)量依次降低，且組間比較均具有統(tǒng)計學差異；提示高層流剪切應力能夠抑制OX-LDL導致的白細胞與內皮細胞之間的黏附，并且隨著層流剪切應力的升高，這種抑制作用明顯增強。

整合素是跨膜糖蛋白異質體，由α及β兩個亞單位組成，每個亞單位由1個巨大的胞外基團、跨膜基團以及小的胞內基團組成。既往研究發(fā)現(xiàn)，活化的β1整合素可介導U937細胞對內皮細胞的黏附。在apoE-/-小鼠模型中，阻斷β1整合素能夠抑制粥樣斑塊的形成。β1整合素能夠同時轉導機械信號，機械刺激能夠使其表達成倍增加[13～16]。許多細胞分子結構具有轉導機械信號的功能，如離子通道、整合素、多糖蛋白質復合物等，這些分子結構在胚胎發(fā)育及許多生理過程中發(fā)揮重要作用[17]。但是在非正常狀態(tài)，如OX-LDL及促炎因子的刺激下，這些分子結構基因的過度表達會導致疾病的發(fā)生[18]。本研究激光掃描共聚焦檢測和流式細胞術檢測結果表明，隨著層流剪切應力的增加，內皮細胞膜β1整合素抗體熒光信號強度逐漸減弱、β1整合素陽性率逐漸降低，其中25 dyne/cm2組β1整合素陽性率明顯低于0 dyne/cm2組，提示層流剪切應力抑制白細胞與內皮細胞黏附的作用機制可能與降低內皮細胞膜表面β1整合素表達有關。

綜上所述，在一定范圍內適當提高層流剪切應力能夠減少高脂環(huán)境下內皮細胞上黏附的白細胞數(shù)量，機制可能與降低內皮細胞膜β1整合素表達有關。但層流剪切應力抑制β1整合素表達的分子機制仍需進一步研究。

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Effect of laminar shear stress on leukocyte endothelial adhesion under hyperlipemia and its mechanism

LIYanling1,HEXiaohong,ZHANGYan,ZHONGTingting,DONGYugang,MAHong,ZHENGZhensheng

(1TheFirstAffiliatedHospitalOfSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China)

Objective To investigate the effect of laminar shear stress on leukocyte-endothelial adhesion in the environment of hyperlipemia and its mechanism. Methods We used oxidized low density lipoprotein (OX-LDL) to make the environment of hyperlipemia then induced the injuries of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). The laminar shear stress at 0, 5 and 25 dyne/cm2was used to intervene HUVECs for 4 h which was taken as the 0, 5 and 25 dyne/cm2groups. U937 cells were applied in the leukocyte-endothelial adhesion experiment, in which the number of U937 cells adherent to HUVECs was counted. Immunofluorescent confocal laser scanning and flow cytometry were respectively used to analyze the fluorescence signal intensity and positive rate of integrin β1in HUVECs. Results The number of leukocyte-endothelial adhesion cells was gradually decreased from 0 dyne/cm2, 5 dyne/cm2and to 25 dyne/cm2groups (allP<0.05). The fluorescence signal intensity of integrin β1in cytomembrane weakened from 0 dyne/cm2, 5 dyne/cm2and to 25 dyne/cm2. The positive rates of integrin β1in 0 dyne/cm2group, 5 dyne/cm2group and 25 dyne/cm2group were 98.98±0.36%, 88.58±3.34% and 81.28±5.19%, respectively, and the positive rate of integrin β1in 0 dyne/cm2group was significantly higher than that in 25 dyne/cm2group (P<0.05), while there was no statistical difference between 0 dyne/cm2and 5 dyne/cm2groups, neither between 5 dyne/cm2and 25 dyne/cm2groups (allP>0.05). Conclusion Increasing laminar shear stress to a relatively high level within proper range could inhibit leukocyte-endothelial adhesion in the environment of hyperlipemia, and its mechanisms may be related to the down-regulation of integrinβ1expression.

atherosclerosis; laminar shear stress; endothelial cells; leukocytes; integrin β1

國家自然科學基金資助項目(30871047)。

李燕玲(1987-)，女，碩士，研究方向為動脈粥樣硬化。E-mail： lililingcom@sina.com

張焰(1967-)，女，副主任醫(yī)師，研究方向為動脈粥樣硬化及增強型體外反搏。E-mail： zhangyangzzsyy@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.005

R543.5

A

1002-266X(2016)16-0015-04

2015-11-12)