先天性顯性脊椎裂胎鼠宮內(nèi)干細(xì)胞移植新方法的建立

趙桂鋒，劉波，苗佳寧，吳迪，李慧，黃天楚，袁正偉

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽110004)

先天性顯性脊椎裂胎鼠宮內(nèi)干細(xì)胞移植新方法的建立

趙桂鋒，劉波，苗佳寧，吳迪，李慧，黃天楚，袁正偉

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽110004)

目的 建立一種先天性顯性脊椎裂胎鼠宮內(nèi)干細(xì)胞移植的新方法。方法 選擇孕16、17、18天的雌性大鼠各30、30、26只，制備先天性顯性脊椎裂胎鼠模型。采用胎仔外科、顯微外科和顯微注射技術(shù)，將轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)移植到脊椎裂胎鼠脊髓中。大鼠孕20天時剖腹、取胎，計(jì)算胎鼠成活率；制作胎鼠脊髓切片，熒光顯微鏡下觀察胎鼠脊髓干細(xì)胞移植情況。結(jié)果 接受手術(shù)的孕鼠86只，孕20天成活81只，成活率為94.2%。行干細(xì)胞移植的先天性顯性脊椎裂胎鼠258只，共取出198只，成活率為76.7%(198/258)，其中胎齡為16、17、18天的胎鼠成活率分別為72.1%(80/111)、77.3%(78/101)、87.0%(40/46)。熒光顯微鏡下觀察胎鼠脊髓切片，可見呈現(xiàn)綠色熒光的MSCs；干細(xì)胞移植成活的胎鼠195只，成活率為98.5%(195/198)。結(jié)論 成功建立先天性顯性脊椎裂胎鼠宮內(nèi)干細(xì)胞移植的新方法；該方法干細(xì)胞成活率較高，可用于神經(jīng)管畸形治療。

先天性顯性脊椎裂；胚胎；顯微手術(shù)；顯微注射；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；移植；大鼠

先天性神經(jīng)管畸形(NTDs)是一種嚴(yán)重的出生缺陷[1], 包括無腦、腦膨出、肛門直腸畸形和脊椎裂等，主要為神經(jīng)管閉合異常所致。 NTDs的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為是胚胎在母體內(nèi)發(fā)育過程中多種基因調(diào)控異常和胚胎發(fā)育環(huán)境有害因素相互作用的結(jié)果[2～4]。近年來干細(xì)胞移植技術(shù)解決了中樞神經(jīng)細(xì)胞不能修復(fù)和再生的難題,為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來希望。2010年8月～2014年11月，我們對先天性顯性脊椎裂胎鼠模型行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)移植,成功建立了NTDs胎鼠宮內(nèi)干細(xì)胞移植新方法，為NTDs的干細(xì)胞治療提供思路。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 成年雌性Wistar大鼠由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室提供[合格證號：SCXK(京)2009-0004]，體質(zhì)量220～250 g，在SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)，陰道涂片確認(rèn)未孕[5～7]。維甲酸(美國Sigma公司)，顯微鑷子、顯微剪刀、顯微針持(張家口奧斯卡醫(yī)療器械有限公司)，6-0顯微縫合線(杭州愛普醫(yī)療器械股份有限公司)，顯微注射針(美國Nikon公司)，手術(shù)顯微鏡(德國Moller公司)，手術(shù)恒溫加熱墊(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 先天性顯性脊椎裂模型建立及處理 取合籠后懷孕的雌性Wistar大鼠86只，參照李勇等[8]、蔡煒嵩等[9]的方法，于大鼠懷孕第10天上午9:00～9:30，按135 mg/kg給予4%維甲酸灌胃,采用顯微外科及胎仔外科技術(shù)制備先天性顯性脊椎裂胎鼠模型(以下稱脊椎裂胎鼠)。取孕16、17、18天的大鼠各30、30、26只，10%水合氯醛按0.32 mL/100 g腹腔麻醉，仰臥位固定于手術(shù)加熱墊上(預(yù)設(shè)38 ℃)，肛門直腸內(nèi)測溫。調(diào)整手術(shù)顯微鏡及座椅，大鼠常規(guī)腹部消毒，腹部正中開腹，暴露雙側(cè)子宮角，術(shù)野外圍鋪溫鹽水紗布。將一側(cè)子宮角輕輕拉出放置于紗布上，清點(diǎn)胚胎數(shù)量，確認(rèn)胚胎頭尾位置，調(diào)整胚胎子宮部位至手術(shù)顯微鏡視野內(nèi)。鏡下確認(rèn)胎鼠脊椎裂部位，于對應(yīng)子宮壁部位做一預(yù)置縫線荷包[10]。逐層剪開子宮壁長約2 mm，暴露羊膜，輕輕推壓子宮壁，調(diào)整脊椎裂位置至清晰暴露于鏡下術(shù)野(此時手術(shù)顯微鏡放大倍數(shù)為20倍，可清晰見到胎鼠的脊髓)，滴加37 ℃預(yù)熱溫生理鹽水保溫、保濕。

1.3 胎鼠脊髓MSCs的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染及移植 參照楊洋等[11]、李志勇等[12]的方法，于無菌條件下取4周齡大鼠的MSCs,采用全骨髓貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng),腺病毒-EGFP(感染復(fù)數(shù)為300～500)轉(zhuǎn)染。暴露孕鼠羊膜，采用獨(dú)立口吸顯微注射技術(shù)[13]抽吸轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白基因的MSCs約2 μL。將顯微注射針移至鏡下術(shù)野，迅速刺入羊膜，輕劃羊膜，使羊水外流。對準(zhǔn)脊髓，進(jìn)針約2 mm，針頭保持2 s，緩慢后退針頭并吹出干細(xì)胞。干細(xì)胞完全注入后，保持針頭在組織內(nèi)不動，同時保持注射針內(nèi)壓力，停止2 s，減少因組織壓力導(dǎo)致移植干細(xì)胞的外溢，之后迅速退出針頭(顯微注射完畢)。輕拉預(yù)先縫合在子宮壁上的荷包縫線，打結(jié)縫合，檢查子宮壁修復(fù)情況，必要時加針縫合加固。將子宮輕輕推回腹腔，并輕輕擠壓腹壁，使其歸位并避免腸梗阻。其他胚胎間隔給予同樣操作后關(guān)腹。

1.4 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.4.1 胎鼠成活情況 取接受干細(xì)胞移植的孕20天大鼠，10%水合氯醛按0.32 mL/100 g腹腔麻醉，固定于手術(shù)托盤中。常規(guī)腹部消毒，腹部正中開腹，暴露雙側(cè)子宮角，術(shù)野外圍鋪溫鹽水紗布。將一側(cè)子宮角輕輕拉出放置在紗布上，清點(diǎn)胚胎數(shù)量，按照手術(shù)記錄查找接受建模的胚胎。打開子宮壁，剖出胚胎，以胚胎有心跳及活動記為胎鼠成活。計(jì)算不同孕齡大鼠的胎鼠成活率。

1.4.2 干細(xì)胞移植成活情況 將經(jīng)干細(xì)胞移植的成活胎鼠脊髓避光小心剝離取出，OCT包埋、避光冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察移植干細(xì)胞，以出現(xiàn)綠色熒光視為干細(xì)胞移植成活，計(jì)算干細(xì)胞移植胎鼠成活率。

2 結(jié)果

接受手術(shù)的孕鼠86只，孕20天成活81只，孕鼠成活率為94.2%。行干細(xì)胞移植的脊椎裂胎鼠258只，共取出接受干細(xì)胞移植的胎鼠198只，成活率為76.7%(198/258)；其中胎齡為16、17、18天的胎鼠成活率分別為72.1%(80/111)、77.3%(78/101)、87.0%(40/46)。熒光顯微鏡下觀察，胎鼠脊髓切片可見呈現(xiàn)綠色熒光的MSCs，見插頁Ⅱ圖1。干細(xì)胞移植成活的胎鼠195只，成活率為98.5%(195/198)，證明干細(xì)胞移植成功。

3 討論

目前, NTDs的治療尚無突破性進(jìn)展,主要原因?yàn)樯窠?jīng)損傷的修復(fù)極其困難。近年來干細(xì)胞移植已深入到各方面科研研究中[14，15]。本研究利用顯微注射、顯微外科和胎仔外科技術(shù)，將轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白基因的MSCs移植入脊椎裂胎鼠的脊髓損傷部位,在大鼠孕20天剖腹取出胎鼠，干細(xì)胞成活率為98.5%。因此，我們認(rèn)為采用本研究方法對脊椎裂胎鼠進(jìn)行干細(xì)胞移植具有較高的干細(xì)胞成活率，可作為研究NTDs治療的方法之一，同時也為其他神經(jīng)系統(tǒng)損傷進(jìn)行干細(xì)胞移植治療提供研究方向?，F(xiàn)將經(jīng)驗(yàn)總結(jié)如下。

3.1 顯微手術(shù)技巧 手術(shù)時間的長短直接影響到胚胎的成活率，因此本研究并沒有采用以往先手術(shù)后縫線的常規(guī)操作，而是預(yù)先在手術(shù)部位做一個縫線荷包，使手術(shù)時間大大縮短，一只胎鼠手術(shù)用時僅為2～3 min。手術(shù)過程中子宮壁開口大小是胚胎是否會被擠出的關(guān)鍵，我們的體會是開口不要超過5 mm。另外本研究注射干細(xì)胞前僅將子宮壁打開，并沒有直接刺破羊膜，一定程度上縮短了在準(zhǔn)備干細(xì)胞注射過程中胚胎暴露于空氣中的時間，同時降低了子宮壁收縮壓力過大導(dǎo)致胚胎被擠出的風(fēng)險，亦是提高胎鼠成活率的重要手段。

3.2 顯微注射技巧 干細(xì)胞注射完畢后外溢是顯微注射操作的一大難題，本研究對此操作進(jìn)行了改良。首先，本研究采用單人吹吸顯微注射法，優(yōu)點(diǎn)為無雙人操作是否配合默契的問題；可根據(jù)自身呼吸控制注射針內(nèi)壓力，從而控制干細(xì)胞的注入速度，也可以輕松控制細(xì)胞流速與退針的速度。其次，進(jìn)針后保持2 s及退針后針尖在組織內(nèi)保持2 s的做法，使干細(xì)胞外溢的可能性大大降低。脊髓本身厚度約為1.5 mm，皮膚及肌肉厚度約為1 mm，本研究保持進(jìn)針深度約為2 mm，在這個深度注射干細(xì)胞能夠確保干細(xì)胞成功注入脊髓。

3.3 術(shù)中與術(shù)后動物護(hù)理 由于體溫調(diào)節(jié)中樞紊亂，動物麻醉后會發(fā)生低體溫，極易導(dǎo)致死亡[16，17]。本研究使用了手術(shù)加熱墊，保持動物體溫在37～38 ℃。溫濕中孔紗布溫度也保持在37～38 ℃，能夠維持子宮角溫度；此外，術(shù)中不斷向子宮角滴加預(yù)熱溫生理鹽水，不僅可以避免子宮角暴露于空氣中，也可以保持子宮所需的溫度及濕度。為降低手術(shù)時間及胎鼠死亡率，本研究將每只孕鼠手術(shù)的胚胎數(shù)控制為3～5只，且間隔進(jìn)行手術(shù)操作，保證從開腹到關(guān)腹時間控制在30 min以內(nèi)。子宮回納到腹腔后，輕輕擠壓腹壁可以使子宮角及腸道回歸原位，避免術(shù)后出現(xiàn)腸梗阻。

本研究中胎齡16、17、18天的脊椎裂胎鼠干細(xì)胞移植后成活率分別為72.1%、77.3%、87.0%，為干細(xì)胞移植治療先天性顯性脊椎裂的最佳時機(jī)提供依據(jù)。本研究總的胎鼠成活率僅為76.7%，說明該技術(shù)仍存在很大的提升空間。

總之，采用顯微注射、顯微外科和胎仔外科技術(shù)對脊椎裂胎鼠進(jìn)行干細(xì)胞移植治療的成功率較高。關(guān)于干細(xì)胞移植治療先天性顯性脊椎裂的療效及其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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A new method of stem cell transplantation in utero for rats with congenital dominant spine bifida

ZHAOGuifeng,LIUBo,MIAOJianing,WUDi,LIHui,HUANGTianchu,YUANZhengwei

(ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Shengyang110004,China)

Objective To establish a novel method of stem cell transplantation in utero for rats with congenital dominant spine bifida. Methods Thirty pregnant female rats (16 days, E16), 30 pregnant female rats (17 days, E17) and 26 pregnant female rats (18 days, E18) were selected to establish the animal models of congenital dominant spine bifida. The bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) transfected with green fluorescent protein (GFP) gene were subsequently transplanted into spinal cord of pregnant rats with congenital dominant spine bifida by fetal surgery, microsurgery and microinjection. The E20 pregnant rats were killed and embryo biopsy was performed to count fetal rat survival rate. The spinal cord stem cell transplantation in fetal rat was observed under the fluorescence microscope. Results The survival rate was 94.2% (81/86) for E20 pregnant rats receiving surgery. One hundred ninety-eight embryo rats with stem cell transplantation survived in 258 rats with congenital spinal bifida fetal, whose survival rate was 76.7% (198/258). The survival rates were 72.1% (80/111), 77.3% (78/101) and 87.0% (40/46) in E16, E17, and E18 fetal rates receiving stem cell transplantation. The GFP was observed in embryo spinal cord under fluorescence microscopy. The survival rate of MSCs was 98.5% (195/198). Conclusions We successfully establish an new method of stem cell transplantation in utero for rats with congenital dominant spine bifida and its stem cell survival rate is high. This method can be used as one of the methods in treatment of neural tube defects.

congenital dominant spine bifida; embryo; microsurgery; microinjection; bone marrow mesenchymal stem cells; transplantation; rats

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81171072)。

趙桂鋒(1983-)，男，助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)閯游镲@微手術(shù)。E-mail： animal_lab@yeah.net

袁正偉(1964-)，男，教授，研究方向?yàn)樾合忍旎巍-mail： yuanzw@sj-hospital.org

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.003

R682.1

A

1002-266X(2016)16-0008-03

2015-11-12)