趨化因子受體CXCR4及基質(zhì)金屬蛋白酶9在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的意義

黃衍楊，吳潤華

趨化因子受體CXCR4及基質(zhì)金屬蛋白酶9在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的意義

黃衍楊1，2，吳潤華1

目的 探討趨化因子受體CXCR4及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中的表達(dá)及臨床意義。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測51例NSCLC患者癌組織及癌旁組織中CXCR4和MMP-9蛋白的表達(dá)情況，分析CXCR4和MMP-9蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 CXCR4和MMP-9蛋白在癌組織中的表達(dá)陽性率均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；NSCLC癌組織中CXCR4及MMP-9的表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期、是否淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)(均P<0.05)；癌組織中CXCR4表達(dá)與MMP-9表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，Cox回歸分析提示CXCR4和MMP-9蛋白表達(dá)、腫瘤大小、TNM分期、是否淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響NSCLC預(yù)后的獨(dú)立因素(均P<0.05)。結(jié)論 CXCR4及MMP-9可能參與了NSCLC發(fā)生發(fā)展過程，二者高表達(dá)提示NSCLC患者預(yù)后不良，聯(lián)合檢測CXCR4及MMP-9的表達(dá)可更好地評(píng)估NSCLC患者的預(yù)后。

非小細(xì)胞肺癌；趨化因子；基質(zhì)金屬蛋白酶；預(yù)后

肺癌作為全球范圍最為常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率一直居高不下[1]。最新的臨床統(tǒng)計(jì)資料表明，2015年我國惡性腫瘤新發(fā)病例429.2萬例，其中肺癌新發(fā)病例73.3萬例，其發(fā)病率在男性惡性腫瘤中位居首位，而在女性中肺癌發(fā)病率也僅次于乳腺癌。2015年全國惡性腫瘤死亡病例281.4萬例，其中肺癌死亡病例61萬例，約占22%，位居我國惡性腫瘤死亡率首位[2]。資料表明90%以上肺癌病理類型為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)[3]，盡管近年來NSCLC的診斷治療方面已取得較大進(jìn)步，但總體療效仍不理想，5 a生存率仍然不足20%[1]，且對(duì)于NSCLC的發(fā)生及發(fā)展過程的相關(guān)分子機(jī)制仍不明確。新近研究表明趨化因子受體CXCR4可能與NSCLC腫瘤細(xì)胞增殖侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)已被證實(shí)在多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)CXCR4可能通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)而促進(jìn)體外NSCLC細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移潛能[5]。本研究擬對(duì)CXCR4及MMP-9在NSCLC中表達(dá)的相關(guān)性及其與NSCLC患者臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 病例資料 本研究選取作者醫(yī)院2008年至2010年治療的原發(fā)性NSCLC患者51例(排除其他腫瘤并發(fā)者)，所有病例收集癌組織及距離癌組織3 cm以上的癌旁組織。所有患者術(shù)前或者收集標(biāo)本前均未進(jìn)行化療、放療等治療，術(shù)后或者無法手術(shù)者均根據(jù)指南進(jìn)行相應(yīng)的輔助治療。其生存期從確診之日開始計(jì)算，終止日期為死亡日期或者末次隨訪日期，截止日期為2016年12月31日。所有病例均經(jīng)病理組織學(xué)確診為原發(fā)性NSCLC，均有完整的病例資料。

1.2 主要試劑 兔多抗CXCR4、MMP-9購自Abcam公司，Elivision試劑盒、胃蛋白酶、H2O2及內(nèi)源性生物素阻斷試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測 所有組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片，采用免疫組織化學(xué)Elivision法染色，嚴(yán)格按照試劑盒說明方法操作。石蠟切片脫蠟水化，高溫枸櫞酸鹽煮沸抗原修復(fù)，3%H2O2孵育，生物素阻斷劑阻斷；分別加入一抗CXCR4、MMP-9多克隆抗體，工作液稀釋比例均為1∶100，加入二抗反應(yīng)，DAB顯色，脫水，透明，封固。已知的陽性切片作陽性對(duì)照，PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 兩位病理科醫(yī)師顯微鏡下獨(dú)立觀察，隨機(jī)采集10個(gè)具有代表性的視野，根據(jù)染色陽性腫瘤細(xì)胞比例及染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。染色陽性細(xì)胞評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①0分，≤10%；②1分，11%～30%；③2分，31%～50%；④3分，≥50%。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①0分，無染色；②1分，弱表達(dá)染色；③2分，中度表達(dá)染色；④3分，強(qiáng)表達(dá)染色。二者相加≥4分為該基因表達(dá)陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中CXCR4、MMP-9表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，Spearman分析CXCR4、MMP-9表達(dá)的相關(guān)性，總體生存率采用Kaplan-Meier法分析，多因素Cox回歸分析綜合評(píng)價(jià)各因素對(duì)患者預(yù)后生存的影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCR4、MMP-9的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示CXCR4、MMP-9在NSCLC癌組織中均呈強(qiáng)-中等強(qiáng)度陽性表達(dá)，陽性定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜上，而癌旁組織中僅散在弱表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞、漿細(xì)胞中，見圖1-2。CXCR4和MMP-9蛋白在癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表1。

A：癌組織 B：癌旁組織圖1 MMP-9的表達(dá)(DAB，×400)

A：癌組織 B：癌旁組織圖2 CXCR4的表達(dá)(DAB，×400)

表1 CXCR4、MMP-9在NSCLC的表達(dá) 例

注：P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 CXCR4、MMP-9的表達(dá)與臨床病理特征 CXCR4的表達(dá)與NSCLC的年齡、性別、吸煙與否、組織病理類型及惡性分化程度無明顯相關(guān)性(均P>0.05)，而與腫瘤大小、TNM分期、是否淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)(均P<0.05)；MMP-9的表達(dá)與NSCLC的年齡、性別、吸煙與否、組織病理類型及惡性分化程度亦無明顯相關(guān)性(均P>0.05)，也與腫瘤大小、TNM分期、是否淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)(均P<0.05)，見表2。

表2 CXCR4、MMP-9的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.3 CXCR4和MMP-9的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析顯示NSCLC癌組織中CXCR4和MMP-9的表達(dá)呈正相關(guān)(r=34.895，P<0.05)，而在癌旁組織中CXCR4和MMP-9的表達(dá)并無相關(guān)性(rs=1.482，P=0.223)，見表2。

2.4 CXCR4、MMP-9表達(dá)與生存期 CXCR4、MMP-9表達(dá)陽性的患者生存率低于CXCR4、MMP-9表達(dá)陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表3。

表3 NSCLC患者預(yù)后影響因素分析

2.5 影響預(yù)后的Cox風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析 對(duì)可能影響NSCLC預(yù)后的相關(guān)因素：CXCR4和MMP-9表達(dá)、腫瘤大小、組織分化程度、TNM分期、是否淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等進(jìn)行多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)模型分析，結(jié)果提示CXCR4和MMP-9表達(dá)、腫瘤大小、TNM分期、是否淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均是影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

3 討論

眾多研究表明細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的降解在惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo-proteinases,MMPs)是一類鋅離子依賴的蛋白內(nèi)切酶，是人體內(nèi)降解ECM的主要酶系。其中MMP-9又被稱為Ⅳ型膠原酶，主要降解ECM基底膜的Ⅳ型膠原及層粘連蛋白而破壞基底膜的完整性，從而促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[6]。研究表明MMP-9的抑制劑則可通過降低腫瘤組織細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)及活性而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[7-8]。Lee等用免疫組織化學(xué)法檢測了417例NSCLC癌組織中MMP-9的表達(dá)情況(其中腺癌患者202例，鱗癌患者175例，其他病理類型40例)，發(fā)現(xiàn)腺癌組織MMP-9的表達(dá)陽性率顯著高于鱗癌組織，MMP-9的表達(dá)與NSCLC患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且肺腺癌患者中MMP-9的表達(dá)與患者的預(yù)后差相關(guān)[9]。然而Zhang等檢測了132例手術(shù)治療的NSCLC癌組織中MMP-9的表達(dá)情況(其中腺癌53例，鱗癌79例)，卻發(fā)現(xiàn)肺鱗癌MMP-9的表達(dá)量要顯著高于肺腺癌患者[10]。Gong等檢測了163例NSCLC血清MMP-9水平及活性，發(fā)現(xiàn)血清MMP-9活性與NSCLC的T分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，并對(duì)22份相關(guān)研究進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NSCLC MMP-9的過表達(dá)與患者TNM分期及預(yù)后差相關(guān)[11]。

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測NSCLC癌組織及癌旁組織中MMP-9的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MMP-9在NSCLC癌組織中呈強(qiáng)-中等強(qiáng)度陽性表達(dá)，陽性定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜上，而癌旁組織中僅于肺泡上皮細(xì)胞、漿細(xì)胞中少量表達(dá)，并且癌組織中MMP-9表達(dá)陽性率顯著高于癌旁組織，提示MMP-9高表達(dá)可能參與NSCLC的發(fā)生。另外，本研究發(fā)現(xiàn)MMP-9的表達(dá)與NSCLC腫瘤大小、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，然而與病理組織類型及組織分化程度無明顯相關(guān)性。另外生存分析發(fā)現(xiàn)MMP-9表達(dá)陽性的NSCLC生存期顯著短于MMP-9表達(dá)陰性患者，多因素Cox分析發(fā)現(xiàn)MMP-9表達(dá)、腫瘤大小、TNM分期、是否淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均是影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示MMP-9表達(dá)可作為NSCLC患者預(yù)后差的指標(biāo)，與Lee及Gong等報(bào)道一致。

趨化因子受體是一類具有跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白偶聯(lián)受體，研究表明趨化因子受體家族通過與其特異性配體結(jié)合的方式參與了惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。最早由Muller等于2001年首先報(bào)道人乳腺癌細(xì)胞中高度表達(dá)趨化因子受體CXCR4，而在乳腺癌常見的轉(zhuǎn)移部位淋巴結(jié)及肺臟等組織中其相應(yīng)配體CXCL12的表達(dá)也相應(yīng)增加，提示CXCR4/CXCL12可能參與了乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程[12]。Choi等研究分別從動(dòng)物和細(xì)胞水平證實(shí)了CXCR4通過CXCL12介導(dǎo)了NSCLC的侵襲轉(zhuǎn)移行為[4]。Zhang等對(duì)研究的19份1 872個(gè)病例進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NSCLC中CXCR4表達(dá)顯著高于正常肺組織，NSCLC患者癌組織中CXCR4的表達(dá)與臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后差相關(guān)[13]。

本研究結(jié)果提示CXCR4與MMP-9同樣在NSCLC癌組織中呈強(qiáng)-中等強(qiáng)度陽性表達(dá)，陽性定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜上，而癌旁組織中僅散在弱表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞、漿細(xì)胞中。并且，CXCR4在NSCLC癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，同時(shí)CXCR4在NSCLC癌組織中的表達(dá)與NSCLC腫瘤大小、TNM分期、是否淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，與胡婷華等報(bào)道一致[14]，提示CXCR4的表達(dá)可能參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展。生存分析發(fā)現(xiàn)CXCR4表達(dá)陽性的NSCLC生存期也顯著短于CXCR4表達(dá)陰性患者，多因素Cox分析發(fā)現(xiàn)CXCR4表達(dá)也是影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與Zhang等報(bào)道一致。Mir等研究表明CXCR6可能介導(dǎo)MMPs表達(dá)增加而增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞株的增殖及侵襲遷移能力[15]。石鋒的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CXCL12/CXCR4分泌環(huán)促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞株的增值侵襲遷移能力，并上調(diào)了MMP-2及MMP-9的表達(dá)，提示CXCL12/CXCR4可能通過分泌MMP-2、MMP-9表達(dá)增加而促進(jìn)NSCLC細(xì)胞株的侵襲轉(zhuǎn)移潛能[5]。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC癌組織中CXCR4蛋白表達(dá)與MMP-9蛋白顯著正相關(guān)，提示聯(lián)合檢測CXCR4及MMP-9的表達(dá)可能更好地評(píng)估NSCLC患者預(yù)后。然而NSCLC癌組織中CXCR4與MMP-9之間究竟存在怎樣的通路關(guān)系，仍然有待進(jìn)一步研究。

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Expression of CXCR4 and MMP-9 in Non-small Cell Lung Cancer and Its Clinical Prognosis

HUANG Yan-yang1,2, WU Run-hua1

(1.Teaching Center for Clinical Skill,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350122,China; 2.Department of Pulmonary Medicine, People′s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350004, China)

ObjectiveTo investigate the expression of CXCR4 and MMP-9 in non-small cell lung cancer(NSCLC) tissues, and analyze their clinical prognosis significance.MethodsThe expressions of CXCR4 and MMP-9 proteins were detected by immunohistochemistry in tumor tissues and corresponding adjacent normal tissue from 51 NSCLC patients. The relationship between CXCR4 and MMP-9 expression in tumor tissues and clinicopathological characteristics and prognosis of NSCLC were analyzed.ResultsThe positive expression rates of CXCR4 and MMP-9 proteins in tumor tissues were significantly higher than those in the corresponding adjacent normal tissue(allP<0.05). A high expression rate of CXCR4 and MMP-9 were significantly associated with tumor size, TNM stage, lymph node metastasis and distant metastasis(allP<0.05). There was a positive correlation between CXCR4 and MMP-9 expression in tumor tissues. Cox regression analysis indicated that the expression of CXCR4 and MMP-9, tumor size, TNM stage, lymphnode metastasis and distant metastasis or not were independent predictors of prognosis for NSCLC.ConclusionCXCR4 and MMP-9 might be involved in the development of NSCLC malignant process, and their high expression might indicate poor prognosis in patients with NSCLC.

non-small cell lung cancer；chemokine；matrix metalloproteinases；prognosis

1672-688X(2017)02-0092-05

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2017.02.004

2017-04-25

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)臨床技能教學(xué)中心，福建福州 350122 2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院肺病科，福建福州 350004

黃衍楊(1983—)，男，福建龍巖人，醫(yī)師，從事呼吸病學(xué)臨床工作。

吳潤華，女，博士，講師，E-mail：wu_runhua@126.com

R734.2

A