流式細(xì)胞儀在檢測(cè)食品中微生物的應(yīng)用研究

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文獻(xiàn)綜述

流式細(xì)胞儀在檢測(cè)食品中微生物的應(yīng)用研究

何方洋①①萬宇平①①賈芳芳①①吳小勝①①羅曉琴①①（①北京勤邦生物技術(shù)有限公司北京 昌平102206①北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心）

流式細(xì)胞儀（flow cytometer）是流式細(xì)胞術(shù)的商品化應(yīng)用，它作為新型高科技儀器，已應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)、海洋、漁業(yè)、釀酒、畜牧、體育科學(xué)、農(nóng)業(yè)、林業(yè)、化工等領(lǐng)域，本文著重介紹了目前流式細(xì)胞儀在檢測(cè)食品中微生物的應(yīng)用研究。

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是一項(xiàng)細(xì)胞分析技術(shù)，不僅能夠快速定量分析和分選液流系統(tǒng)中單個(gè)細(xì)胞或其它生物微粒，而且可以實(shí)現(xiàn)分類收集特定細(xì)胞或細(xì)胞器。流式細(xì)胞儀（ flow cytometer）是流式細(xì)胞術(shù)的商品化應(yīng)用，它作為新型高科技儀器，已應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)、海洋、漁業(yè)、釀酒、畜牧、體育科學(xué)、農(nóng)業(yè)、林業(yè)、化工等領(lǐng)域，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞儀在檢測(cè)食品中微生物方面應(yīng)用發(fā)展起來［1］。檢測(cè)食品中微生物是評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生的一個(gè)重要指標(biāo)，目前發(fā)布的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)以及地方標(biāo)準(zhǔn)中涉及到的食品中微生物的檢測(cè)方法主要有：交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法、環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增（LAMP）法、免疫磁珠法、分子分型SPA基因分型方法、熒光PCR法、Baird-parker瓊脂培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法、電泳和免疫印跡法、免疫色譜反應(yīng)法、酶聯(lián)免疫法等［2-10］。隨著人們對(duì)食品安全要求的提高，相對(duì)于其他檢測(cè)手段，流式細(xì)胞術(shù)已成為一種被認(rèn)可的重要分析技術(shù)，利用細(xì)胞能夠自發(fā)熒光，并且標(biāo)記不同的熒光素（蛋白、核酸等），流式細(xì)胞儀通過散射光可以在流動(dòng)的狀態(tài)中檢測(cè)細(xì)胞各種物理及生物特征。

1　流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)、原理及機(jī)型

1.1流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞儀主要由五個(gè)部分組成：流動(dòng)室和液流系統(tǒng)；激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測(cè)系統(tǒng)；計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)；細(xì)胞分選系統(tǒng)［11-13］。其中，流動(dòng)室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，是液流系統(tǒng)的心臟。

1.2流式細(xì)胞儀原理由于超聲振蕩器產(chǎn)生高頻振蕩，使流動(dòng)室發(fā)生振動(dòng)，因此，能夠把噴嘴噴出的細(xì)胞液流斷裂成一連串的均勻小液滴，其中部分液滴含有細(xì)胞。在待測(cè)細(xì)胞形成液滴前，光學(xué)系統(tǒng)已測(cè)定出細(xì)胞的性質(zhì)，如果發(fā)現(xiàn)了目標(biāo)細(xì)胞，則在該目標(biāo)細(xì)胞剛形成液滴時(shí)，儀器給整個(gè)液流充以短暫的正電荷或負(fù)電荷。當(dāng)該液滴離開液流后，其中目標(biāo)細(xì)胞的液滴就帶有電荷，而其他細(xì)胞的液滴則不帶電。帶有正電或負(fù)電的液滴通過高壓偏轉(zhuǎn)板時(shí)，會(huì)發(fā)生向陰極或向陽極的偏轉(zhuǎn)，從而達(dá)到了分類收集細(xì)胞的目的。整個(gè)儀器用多道脈沖高度分析器處理熒光脈沖信號(hào)和光散射信號(hào)，測(cè)定的結(jié)果用單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點(diǎn)圖、三維立體圖和輪廓（等高）圖來表示［14-16］。

1.3流式細(xì)胞儀基本機(jī)型目前，主要生產(chǎn)流式細(xì)胞儀的公司有德國(guó)的Partec公司、美國(guó)的BD公司和貝克曼庫爾特公司［17-18］。儀器主要分為臨床分析型和科研分選型，前者主要應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室，后者則適于廣泛的科研領(lǐng)域。隨著電子制造技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、熒光素合成等技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞儀開始向模塊化發(fā)展，其電子系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、檢測(cè)器單元等均可以按照試驗(yàn)要求隨意更換［19-20］，以滿足用戶的不同需求。

2　流式細(xì)胞儀在食品微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用

流式細(xì)胞儀曾經(jīng)在第二次世界大戰(zhàn)中用來檢測(cè)細(xì)菌和孢子，后來隨著流式細(xì)胞儀的商業(yè)化發(fā)展，用來檢測(cè)哺乳類生物細(xì)胞，直到上世紀(jì)90年代末，由于儀器光學(xué)系統(tǒng)的改進(jìn)，以及新熒光素的發(fā)現(xiàn)，流式細(xì)胞儀在微生物學(xué)的應(yīng)用快速發(fā)展起來。而在食品工業(yè)應(yīng)用中，流式細(xì)胞儀已被應(yīng)用于釀酒、面包發(fā)酵、飲料等行業(yè)［21-23］，它已成為微生物檢測(cè)的常用工具。

2.1應(yīng)用于細(xì)菌活性的判斷流式細(xì)胞儀能夠鑒定食品中微生物的活性，因?yàn)榛罴?xì)胞具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，一般的熒光染料無法進(jìn)入，只能進(jìn)入細(xì)胞膜受損的細(xì)胞中。而有些染料可以進(jìn)入所有死細(xì)胞和活細(xì)胞內(nèi)，其進(jìn)入量有差別。如果將兩種特性的染料結(jié)合應(yīng)用，配合熒光微球，即可快速鑒別并計(jì)數(shù)死/活細(xì)胞。該特性既可以評(píng)價(jià)食品的殺菌效果，也可以評(píng)價(jià)食品中有益菌的含量［24-26］。

2.2應(yīng)用于食源性致病菌的檢測(cè)目前，已有學(xué)術(shù)研究報(bào)道利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)生乳、果汁等食品中致病菌數(shù)量，這些報(bào)道同時(shí)也比較了平板計(jì)數(shù)法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)間只需2h左右，而平板計(jì)數(shù)法則需要5d左右，而且在一定濃度范圍內(nèi)，前者具有更好的符合性，更加靈敏、準(zhǔn)確、高通量，對(duì)液態(tài)食品的貨架期、倉(cāng)儲(chǔ)、保質(zhì)期、出口等順利進(jìn)行提供了高效的技術(shù)平臺(tái)［27-29］。而在現(xiàn)實(shí)生活中，食品的生產(chǎn)、運(yùn)輸、消費(fèi)過程均存在微生物污染的可能，食源性疾病是食品安全中最突出的問題，流式細(xì)胞儀已成為檢測(cè)霉菌、酵母菌、大腸桿菌、沙門氏菌等多種病原菌的有力手段［30-32］。

2.3應(yīng)用于食品中微生物的在線檢測(cè)流式細(xì)胞儀能夠檢測(cè)食品中目標(biāo)微生物的數(shù)量，能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，因此滿足了批量樣品的在線檢測(cè)需求。有人設(shè)計(jì)了一種低通量的流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)，能夠?qū)崟r(shí)、在線監(jiān)測(cè)生物反應(yīng)器中菌體生長(zhǎng)的變化過程。與其他熒光檢測(cè)方法相比，只有流式細(xì)胞儀可以從大量弱熒光信號(hào)的菌體中辨別出少量熒光信號(hào)強(qiáng)的菌體，由于流式細(xì)胞儀能夠提供精確、可靠的檢測(cè)結(jié)果，因此可以從中選擇穩(wěn)定的高產(chǎn)量理想菌株［33-35］。

3　結(jié)論與展望

流式細(xì)胞儀的使用解決了一些傳統(tǒng)檢測(cè)手段的缺點(diǎn)，比如檢測(cè)周期過長(zhǎng)，無法大批量檢測(cè)樣本［36-37］，流式細(xì)胞儀能夠保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能不被破壞，通過熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號(hào)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選，目前已成為食品中微生物質(zhì)量檢測(cè)的一種有力手段。然而，流式細(xì)胞儀在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用僅是冰山一角［38-42］，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞儀的功能將越來越強(qiáng)大，逐步向儀器小型化，操作自動(dòng)化的方向發(fā)展。

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