羊棘球蚴（包蟲）病基因工程亞單位疫苗的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用

曹　政，趙揚(yáng)揚(yáng)，林　雅，李春燕，劉曉竹，鄧燦新（.重慶澳龍生物制品有限公司，重慶榮昌40460；.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶榮昌40460）

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羊棘球蚴（包蟲）病基因工程亞單位疫苗的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用

曹政1，趙揚(yáng)揚(yáng)1，林雅1，李春燕1，劉曉竹1，鄧燦新2
（1.重慶澳龍生物制品有限公司，重慶榮昌402460；2.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶榮昌402460）

摘要：本文對(duì)羊棘球蚴（包蟲）病基因工程亞單位疫苗的工業(yè)化生產(chǎn)工藝及應(yīng)用效果進(jìn)行了研究，為有效防控包蟲病在人畜間傳播奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：包蟲病；基因工程亞單位疫苗；Eg85；工業(yè)化生產(chǎn)

棘球蚴病又稱包蟲病，是人和動(dòng)物感染細(xì)粒棘球絳蟲及多房棘球絳蟲的幼蟲所致的疾病。包蟲病是嚴(yán)重危害人體健康和生命安全、影響畜牧業(yè)健康發(fā)展的重大人畜共患寄生蟲病之一。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為B類動(dòng)物疾病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病和人獸共患?。?］。本文對(duì)羊棘球蚴（包蟲）病基因工程亞單位疫苗的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用進(jìn)行了研究，為包蟲病的預(yù)防提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種本文所用菌種由重慶澳龍生物制品有限公司提供。

1.1.2試驗(yàn)羊只試驗(yàn)所用綿羊（240只）由新疆維吾爾自治區(qū)、內(nèi)蒙古自治區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)提供；試驗(yàn)用山羊（240只）由四川省甘孜州及阿壩州某養(yǎng)殖場(chǎng)提供。

1.1.3工藝輔料種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基；包涵體洗液I、包涵體洗液II為自制；變性液為8mol尿素變性液。

1.2方法

1.2.1檢測(cè)方法SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的條帶，多聯(lián)酶標(biāo)儀測(cè)定總蛋白含量，BandScan軟件分析目的蛋白含量，按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》（指2010版，下同）檢測(cè)成品中水分含量、無(wú)菌效果、真空效果，完成安全檢驗(yàn)及效力檢驗(yàn)。

1.2.2檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)羊棘球蚴（包蟲）病基因工程亞單位疫苗的成品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)包括：外觀檢測(cè)成品應(yīng)為乳白色疏松固體；蛋白純度檢測(cè)Eg85純度應(yīng)不低于60%，每頭份成品中Eg85蛋白含量不少于50 μg，Quil A佐劑不少于1mg。疫苗整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行GMP相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，疫苗成品的真空度、水分殘留、外源微生物都要符合《中華人民共和國(guó)獸藥典》的要求。

2　具體生產(chǎn)工藝

2.1工業(yè)化生產(chǎn)車間重慶澳龍生物制品有限公司于2008年建成了世界上第一條包蟲病疫苗生產(chǎn)流水線，產(chǎn)品于2011年投放市場(chǎng)，現(xiàn)已大規(guī)模生產(chǎn)和上市銷售。

2.2發(fā)酵工藝

2.2.1一級(jí)種子制備取一支-80℃保存的工作種子，按1%分別接種于兩份LB（Amp+、Chl）培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，轉(zhuǎn)交于發(fā)酵生產(chǎn)線。

2.2.2二級(jí)種子制備取一瓶50mL生長(zhǎng)于對(duì)數(shù)期的一級(jí)種子，按1%～2%接種于1.5 L LB（Amp+）培養(yǎng)基中，共接種8瓶，150r/min37℃振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)夜至飽和后，將二級(jí)種子收集在一起，放4℃暫存。

2.2.3高密度發(fā)酵在正式發(fā)酵前一天，按配方配制合成培養(yǎng)基，并在發(fā)酵罐中進(jìn)行實(shí)消，保持罐壓不低于0.03MPa。正式發(fā)酵時(shí)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基溫度至37℃，調(diào)節(jié)pH值在7.0。按比例加入終濃度為0.1%的Amp。接入二級(jí)種子，攪拌速度開(kāi)至150r/min，初始罐壓保持0.04 MPa，37℃培養(yǎng)發(fā)酵8～10h，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)后期時(shí)，添加終濃度為1mmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，發(fā)酵完成后對(duì)菌體進(jìn)行滅活。

2.3純化工藝

2.3.1菌體初純對(duì)已滅活菌體進(jìn)行15000r/min離心，離心后菌體用1%NaCl重懸，通過(guò)高壓均質(zhì)機(jī)破碎細(xì)胞，破碎后通過(guò)管式連續(xù)離心機(jī)離心，收集菌體。

2.3.2菌體精純提前配制精洗液I與精洗液II，破碎后包涵體用精洗液I重懸，常溫?cái)嚢?～2 h，攪拌結(jié)束后離心收集包涵體再用精洗液II重懸并攪拌1～2h，管式連續(xù)離心機(jī)離心，收集包涵體。

2.4半成品制備工藝

2.4.1包涵體變性將精洗后合格的包涵體按1﹕20比例用變性液重懸，在37℃條件下攪拌過(guò)夜。攪拌結(jié)束后用管式連續(xù)離心機(jī)離心去除雜質(zhì)，離心后變性液用0.45nm與0.22nm孔徑的超濾裝置超濾，回流液殘留用0.45nm與0.22nm平板濾器過(guò)濾。

2.4.2除菌過(guò)濾變性液經(jīng)過(guò)濾后，繼續(xù)用0.45nm 及0.22nm平板濾器在無(wú)菌條件下進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。過(guò)濾后的變性液送樣檢測(cè)是否存在雜菌，質(zhì)量不達(dá)標(biāo)則需重復(fù)操作。

2.4.3佐劑配制將Quli A佐劑用復(fù)性液配制成150mg/mL的佐劑母液，用平板濾器作無(wú)菌過(guò)濾。過(guò)濾后佐劑母液送樣檢測(cè)是否存在雜菌，若質(zhì)量不達(dá)標(biāo)則需重復(fù)操作。

2.5配苗分裝工藝取半成品變性液及佐劑母液各一份，在攪拌條件下用無(wú)菌復(fù)性液快速?gòu)?fù)性，按照3.0mL/瓶進(jìn)行分裝配苗，分裝完成的苗液需要凍干，凍干完成后進(jìn)行壓蓋、貼標(biāo)、裝盒。

3　成品檢測(cè)

3.1物理性狀檢驗(yàn)本疫苗成品應(yīng)表現(xiàn)為白色海綿狀疏松團(tuán)塊，加入稀釋液后迅速溶解。

3.2真空度檢驗(yàn)凍干、壓蓋后的成品應(yīng)具有一定的真空度，按現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行真空度測(cè)定，應(yīng)為紫色光輝。

3.3剩余水分檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行測(cè)定，成品水分含量不得超過(guò)3.5%。

Industrial Production and Application of Hydatidosis Genetic Subunit Vaccine on Sheep

CAO Zheng1，ZHAO Yangyang1，DENG Canxin2，et al.
（1.Chongqing Auleon Biologicals Co.Ltd.，Chongqing Rongchang 402460；2.Department of Veterinary Medicine of Rongchang Campus，Southwest University，Chongqing Rongchang 402460，China）

Abstract：This paper researched the industrial production technics and application effect of hydatidosis genetic subunit vaccine on sheep，it aimed at prevention and control hydatidosis spread between people and animals.

Key words：Hydatidosis；Genetic engineering subunit vaccine；Eg85；Industrial production

中圖分類號(hào)：S858.272.734

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1001-8864（2016）05-0028-03

收稿日期：2016-03-28

基金項(xiàng)目：重慶市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（cstc2015jcsf-ny cgzhA10002）

作者簡(jiǎn)介：曹政（1884-），男，內(nèi)蒙古錫林浩特市人，研究員，博士，從事微生物分子生物學(xué)研究。