生物反應器生產(chǎn)狂犬病疫苗的工藝應用

張瑜/北京信得威特科技有限公司

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生物反應器生產(chǎn)狂犬病疫苗的工藝應用

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狂犬病是一種致死率非常高的人畜共患病，我國列為甲類傳染病，是重要防控疫病。由于尚無非常有效的治療方法，因此暴露于該病原后，接種疫苗是最重要預防措施之一。2015年OIE的狂犬病控制計劃指出，95%的人狂犬病是由病犬咬傷所致，如果實現(xiàn)70%以上的犬免疫，可將人的狂犬病發(fā)病率極大降低。與人預防該病相比，所消耗的費用成本節(jié)約近10倍。此外加強狗和野生動物狼等易感動物免疫是逐漸凈化本病的根本方法。

自從1885年，Louis Pasteur首次用兔腦和脊髓制備了狂犬病弱毒疫苗，成功保護了第一位狂犬病野毒暴露者。此后，在疫苗安全性和免疫效果方面不斷改進和提高?？袢∫呙缃?jīng)歷了神經(jīng)組織疫苗，禽胚疫苗，細胞培養(yǎng)疫苗的發(fā)展歷程。

一、狂犬病疫苗毒株及培養(yǎng)基質(zhì)

1.狂犬病疫苗的發(fā)展。最早的狂犬病疫苗是用感染疫苗毒株的動物腦和脊髓神經(jīng)組織制備而成。由于其效價低，免疫產(chǎn)生抗體水平較差，且含有大量神經(jīng)髓磷脂，存在引發(fā)變態(tài)反應等缺點。此后，開發(fā)出禽胚組織培養(yǎng)狂犬病疫苗。1955年，Peck制備了鴨胚疫苗（DEV）。雖然鴨胚疫苗在生產(chǎn)工藝又有進一步改善，引起變態(tài)反應的危險性降低，但仍然表現(xiàn)出免疫后抗體效價低的特點。第三代疫苗走上歷史舞臺，將狂犬病病毒適應于細胞培養(yǎng)，生產(chǎn)細胞培養(yǎng)狂犬病疫苗，主要包括原代細胞疫苗、二倍體細胞疫苗和傳代細胞疫苗。隨著生產(chǎn)工藝改進，第三代疫苗免疫效果好，副反應少，能夠?qū)崿F(xiàn)大批量生產(chǎn)，肩負起了目前免疫防控狂犬病的重任。雖然，狂犬病基因工程疫苗也進行很多研究，包括重組活載體疫苗、亞單位疫苗和基因疫苗等。

2.狂犬病疫苗毒株。由于狂犬病分布廣泛，各個國家和地區(qū)依據(jù)本國疫情流行情況，培養(yǎng)篩選出不同的狂犬疫苗毒株。應用最為廣泛的毒株來源于3個疫苗株：1882年從狂犬病病犬脊髓分離并通過兔體傳代的固定毒巴斯德株(Paris-Pasteur 株)；1939年從美國一個患病女孩脊髓懸液經(jīng)鼠腦傳代分離，以雞胚傳代的固定毒Flury株；1935年美國一個患病犬體內(nèi)分離的SAD株，經(jīng)鼠腦傳代固定毒SAD株。SAD株是弱毒疫苗株，經(jīng)過分離篩選出的SAD Bern， SAG2， 和SAD B19等毒株，生產(chǎn)弱毒口服疫苗，在歐洲廣泛用于野生動物的免疫，取得了明顯的疫病防控效果。為了排除口服弱毒疫苗SAD株免疫動物后毒力返強的可能性，進行了現(xiàn)有弱毒株基因重組，以用于更換現(xiàn)有的口服弱毒疫苗株。

3.狂犬病疫苗培養(yǎng)基質(zhì)。原代細胞培養(yǎng)相對簡單，能夠用于較多狂犬病毒株培養(yǎng)?？袢《維AD株、Paris-Pasteur株和aGT株適應原代地鼠腎細胞培養(yǎng)，F(xiàn)lury-LEP株及Flury-HEP在雞胚成纖維細胞上培養(yǎng)，生產(chǎn)出弱毒疫苗和滅活疫苗，廣泛用于人和動物的狂犬病預防免疫。原代細胞質(zhì)量有批間差異，存在潛在的病毒等外源因子污染等缺點，應用變少。

二倍體細胞與原代細胞相比，具有能夠充分鑒定和標準化的優(yōu)點，可實現(xiàn)細胞種子庫系統(tǒng)，建立的細胞庫可多年用于生產(chǎn)，有利于質(zhì)量控制。但其對培養(yǎng)條件要求較為苛刻，生產(chǎn)成本也較高，價格昂貴，獸用疫苗應用較少。傳代細胞與二倍體細胞優(yōu)點相似，但其易于培養(yǎng)，而得到較為廣泛應用。1962年，日本千葉大學學者分離培養(yǎng)出非洲綠猴腎細胞（Vero），適用于狂犬病毒株CTN、aG和PM株的滅活疫苗生產(chǎn)，用于狂犬病預防。我國于1995年開始進行人用純化Vero細胞狂犬病疫苗的研制，已有多家生物制品公司獲得了生產(chǎn)文號。1961年，A．Macpherson和M．G．．P．Stoker 從1日齡倉鼠分離出幼倉鼠腎細胞（BHK），并培養(yǎng)成為細胞系。BHK細胞對狂犬病病毒敏感性高，增殖培養(yǎng)PM 株、ERA 株SAD株及CTN-181株等毒株。法國維克用BHK-21細胞培養(yǎng)（VP12株）生產(chǎn)的犬、貓用狂犬病疫苗，獲得了在法國生產(chǎn)文號，并在我國進行了注冊。在國內(nèi)，BHK-21傳代細胞培養(yǎng)HEP-Flury 株生產(chǎn)滅活疫苗，經(jīng)過安全性和免疫效力檢驗合格，NIH檢驗達到2IU。

二、生物反應器細胞培養(yǎng)狂犬病疫苗工藝應用

1962年，Capstile成功完成BHK-21細胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)。1967年，Van Wezel首先開創(chuàng)了微載體細胞培養(yǎng)技術(shù)，標志生物反應器培養(yǎng)動物細胞技術(shù)的起步。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，其已廣泛用于疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域，因其具有節(jié)約生產(chǎn)所需的空間，生產(chǎn)過程易于監(jiān)控，實現(xiàn)自動化、規(guī)?；a(chǎn)，降低批次產(chǎn)品間差異的優(yōu)點。生物反應器生產(chǎn)疫苗工藝正在被廣泛接受。

狂犬病疫苗生產(chǎn)用細胞為貼壁依賴性，包括原代細胞、二倍體細胞和傳代細胞，適用于生物反應器微載體培養(yǎng)。培養(yǎng)類型分為微載體懸浮培養(yǎng)和固定床微載體培養(yǎng)。微載體懸浮培養(yǎng)工藝采用攪拌槳式生物反應器，能夠懸浮的球狀載體。依據(jù)病毒株和細胞的培養(yǎng)特點，優(yōu)化狂犬病疫苗生產(chǎn)工藝，通過對反應器物理結(jié)構(gòu)等比例放大，應用于生產(chǎn)。1984年，法國Merieun研究所在微載體懸浮培養(yǎng)的Vero細胞上繁殖狂犬病毒PM1503-3M株，制備出純化Vero細胞狂犬病疫苗（Purified Vero Rabies Vaccine， PVRV）。該苗免疫原性好、安全、穩(wěn)定，可大規(guī)模生產(chǎn)，產(chǎn)量高，價格便宜，WHO推薦使用Vero細胞大量生產(chǎn)狂犬疫苗。攪拌槳生物反應器培養(yǎng)BHK-21細胞，接入狂犬病PV株種毒，培養(yǎng)出高滴度病毒抗原液，便于下游純化工藝，制備出低成本，免疫效果好的疫苗。Cytodex1微載體懸浮培養(yǎng)Vero細胞，與常規(guī)含血清培養(yǎng)液相比，無動物成分培養(yǎng)液更適于Vero細胞生長，得到更高效價抗原液。該工藝的開發(fā)，將簡化下游工藝，降低疫苗副反應。

固定床微載體細胞培養(yǎng)生物反應器突破原有技術(shù)瓶頸，逐漸擴大應用范圍。固定床微載體多采用具有一定結(jié)構(gòu)的聚酯纖維載體例如Fibra-Cel disks和BioNOC II Matrix。有實驗發(fā)現(xiàn)，與Cytodex1載體懸浮培養(yǎng)相比，固定床載體Fibra-Cel disks的培養(yǎng)的細胞密度更高，單位細胞產(chǎn)能，病毒產(chǎn)毒量均有提高。固定床生物反應器一般具有較低細胞剪切力，獨特的暴氣方式和傳質(zhì)效率等特點，形成特有的培養(yǎng)體系。與攪拌槳反應器相比，iCELLis固定床生物反應器更適于MRC-5細胞培養(yǎng)。固定床反應器的載體為大孔微載體，存在生物反應器逐級放大和大體積培養(yǎng)的工藝瓶頸，因此更適于致細胞病變?nèi)醯目袢《局甑纳a(chǎn)。

狂犬病仍是我國需要防控的致死率高的烈性傳染病，而被患病犬咬傷是主要根源，因此應加強與人類接觸頻繁的寵物犬和流浪犬等免疫。隨著國家對易感動物強制接種的力度不斷加大和未來啟動凈化本病，對狂犬疫苗滅活疫苗和口服弱毒疫苗的需求也會日益增加。結(jié)合我國狂犬病獸用疫苗株和細胞特點，選用合適生物反應器建立疫苗抗原生產(chǎn)工藝，生產(chǎn)出價格低的優(yōu)質(zhì)病毒抗原液。為保證產(chǎn)品具有穩(wěn)定免疫效力，較高的安全性和最低副反應，生產(chǎn)企業(yè)應對狂犬病疫苗下游濃縮，純化和配苗佐劑的工藝進一步開發(fā)，以提供充足有效的狂犬病疫苗。

參考文獻（略）