HLA-B27在檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎方法上的研究進(jìn)展

中國(guó)人民解放軍第211醫(yī)院（150080）張怡 王富禹

強(qiáng)直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)又稱變形性脊柱炎、類風(fēng)濕性脊椎炎，它是一種自身免疫性疾病。發(fā)病部位主要包括骶髂關(guān)節(jié)、脊柱骨突和脊柱旁軟組織，這當(dāng)中以骶髂關(guān)節(jié)病變最多見(jiàn)，常可致畸，且該病具有遺傳性，但現(xiàn)如今發(fā)病機(jī)理尚不確切。強(qiáng)脊炎多累及青壯年，據(jù)報(bào)道在國(guó)內(nèi)的患病率為0.26%[1]。正因?yàn)槠洳∫驈?fù)雜，早期沒(méi)有典型的影像學(xué)改變，發(fā)病不明顯，又常見(jiàn)腰背腿痛，在臨床上往往與其他的腰腿痛相模糊。增加了臨床上誤診和漏診的幾率，這就使得AS患者從發(fā)現(xiàn)癥狀到確診疾病通常在5～6年以上[2][3]。AS患者的平均年齡為29.4歲及性別多為男性，異于HLA-B27陽(yáng)性的非AS患者、HLA-B27陰性的非AS患者，對(duì)健康體檢者資料統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析，揭示了該病具有很明顯的特異性[4]。該病的另一特點(diǎn)：早期進(jìn)展慢，后期進(jìn)展快，可以在很短時(shí)間內(nèi)形成駝背畸形，關(guān)節(jié)強(qiáng)直。由此可見(jiàn)，早期的臨床診斷就顯得格外重要了。正因?yàn)镠LA-B27抗原在AS發(fā)病過(guò)程中扮演了重要的角色，加之較強(qiáng)的相關(guān)性，使得HLA-B27的檢測(cè)可為AS的診斷和鑒別提供堅(jiān)定的依據(jù)[5][6]。

1 HLA-B27基因?qū)W特性

HLA（Human Leukocyte Antigen，人類白細(xì)胞抗原又稱移植抗原）是人類主要組織相容性復(fù)合體的表達(dá)產(chǎn)物，是一種多態(tài)系統(tǒng)，在機(jī)體當(dāng)中可識(shí)別細(xì)胞和誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。HLA-B27同一亞型在不同人群中與AS的關(guān)聯(lián)程度也各有不同，2702、2704、2705亞型與AS的發(fā)生呈正相關(guān)，而2703、2707、2708、2709與AS的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)[7]。其次研究還發(fā)現(xiàn)，B27基因多態(tài)性存在地域性差異，尤其是在AS患者中的分布和誘發(fā)AS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)方面尤為突出，可見(jiàn)地區(qū)不同的人群中，患者在遺傳學(xué)和發(fā)病機(jī)制上是不同的[8]。不僅如此，HLA-B27抗原的表達(dá)也與其他種類的疾病相關(guān)。由此可見(jiàn)，臨床的診斷離不開(kāi)HLA-B27檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2 HLA-B27的檢測(cè)方法

CT具有較高的分辨率，能夠?qū)S骶髂關(guān)節(jié)病變進(jìn)行較準(zhǔn)確的分級(jí)，是診斷AS骶髂關(guān)節(jié)病變的主要檢查方法；而MRI能夠顯示脂肪沉積、關(guān)節(jié)軟骨異常及骨髓水腫等改變，可作為AS骶髂關(guān)節(jié)病變的早期診斷方法[9]。骶髂關(guān)節(jié)CT與HLA-B27檢測(cè)結(jié)果高度契合，無(wú)顯著性差異，有助于早期診斷。骶髂關(guān)節(jié)CT檢測(cè)結(jié)果可為強(qiáng)脊炎各個(gè)時(shí)期臨床分期的重要依據(jù)來(lái)源[10]。

目前臨床上檢測(cè)H L A-B 2 7基因的方法隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展而不斷進(jìn)步，一類是抗原水平的血清學(xué)檢測(cè)法，包括經(jīng)典的微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)（Microlymphocytotoxicity text，MLCT）又稱補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞分析法；另一類則是基因水平的DNA分型技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)PCR-SSP法、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)。目前對(duì)于HLA-B27的研究已經(jīng)深入到等位基因水平。

2.1 微量淋巴細(xì)胞毒法 微量淋巴細(xì)胞毒法(MLCT)，原理是淋巴細(xì)胞與血清中特異性抗體結(jié)合，加入補(bǔ)體可使細(xì)胞溶解、死亡。因?yàn)榧?xì)胞膜具有不同的通透性，染料只能使得死細(xì)胞著色，接下來(lái)根據(jù)死細(xì)胞占的百分比，判斷是否存在HLA-B27抗原及其與抗體的反應(yīng)強(qiáng)度。田衛(wèi)花等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MLCT法敏感度達(dá)0.801[11]。但目前認(rèn)為，MLCT方法可能會(huì)因感染等因素影響B(tài)27分子的數(shù)量或影響其分子結(jié)構(gòu)而造成假陰性。除此之外，還要求淋巴細(xì)胞的活力要高，過(guò)度破碎的細(xì)胞容易造成假陽(yáng)性。因此，雖說(shuō)MLCT方法操作簡(jiǎn)便，但不足之處為最少需要新鮮血液3mL且一定要有足夠多的活淋巴細(xì)胞，純度的高低、單抗效價(jià)、補(bǔ)體差異的不同情況都會(huì)影響結(jié)果，靈敏度較差、操作費(fèi)時(shí)，以上都會(huì)造成漏檢或假陽(yáng)性等不被希望出現(xiàn)的結(jié)果[12]。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)法 流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）是一種新型的分選技術(shù)和分型技術(shù)，能快速地測(cè)量細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。再結(jié)合單克隆抗體，迅速區(qū)分出淋巴細(xì)胞亞群，以此檢測(cè)HLA-B27抗原陽(yáng)性的細(xì)胞百分比，判斷其是否為陽(yáng)性則依據(jù)檢測(cè)出的標(biāo)定陽(yáng)性值。臨床上的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、快速，但是仍存在儀器昂貴，對(duì)操作人員及待測(cè)樣本的質(zhì)量要求較高等問(wèn)題，并且由于熒光易淬滅，限制了這項(xiàng)技術(shù)的推廣，所以當(dāng)前其只能在規(guī)模較大的醫(yī)院應(yīng)用。此外，HLA-B27與其他的HL A-B族抗原之間差異較小，免疫學(xué)檢測(cè)存在較高的交叉反應(yīng)，假陽(yáng)性率較高，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[13]。流式細(xì)胞儀檢測(cè)法特異性不高，與所用的單克隆抗體有關(guān)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成假陽(yáng)性的影響，而使特異性下降[14]。

2.3 PCR-SSP PCR-SSP（sequence specific primer）即序列特異引物引導(dǎo)的PCR反應(yīng)。設(shè)計(jì)出一整套等位基因組特異性引物，擴(kuò)增該特異性引物，將PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析，出現(xiàn)目的條帶即為陽(yáng)性。隨著基因領(lǐng)域在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，以PCR為基礎(chǔ)，已經(jīng)逐漸演變出PCR-SSP，實(shí)時(shí)熒光定量PCR等多種基因檢測(cè)方法，具有較高的靈敏度和特異性?？梢院芎玫谋苊庋鍖W(xué)方法的大多數(shù)缺點(diǎn)和不足，并且可以進(jìn)一步區(qū)分HLA-B27的多種亞型，是HLA-B27檢測(cè)的發(fā)展方向[15]。黃寶英等人研究發(fā)現(xiàn)用PCR檢測(cè)B27基因比流式細(xì)胞儀檢測(cè)的準(zhǔn)確性更高[16]。艾金偉等人經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)FCM法和PCR-SSP檢測(cè)HLA-B27對(duì)AS的診斷準(zhǔn)確性相當(dāng)[17]。于莉的研究表明，PCR-SSP法、FCM法及MLCT法三種方法檢測(cè)血清HLA-B27對(duì)診斷AS的特異度均較高，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）[18]。因此，在臨床上還需要大量的檢測(cè)樣本數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)一步對(duì)診斷準(zhǔn)確性的研究進(jìn)行驗(yàn)證。

2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù) 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)就是指將熒光基團(tuán)加入PCR反應(yīng)體系，根據(jù)熒光信號(hào)積累情況的不同來(lái)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后未知模板通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)比來(lái)定量分析。用實(shí)時(shí)熒光定量法對(duì)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HLA-B27抗原為臨界值邊緣樣本具有重要價(jià)值，該法的臨床適用性比FCM更具優(yōu)勢(shì)。熒光定量PCR法是近年來(lái)發(fā)展較快的一種檢測(cè)手段，具有傳統(tǒng)的PCR所不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，該項(xiàng)技術(shù)對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎的早期和輔助診斷具有重要的臨床意義[19]。戎奇吉等人研究利用兩種比較成熟的熒光定量法：SYBR染料法和Taqman特異探針?lè)ǎ瑯?gòu)建了相關(guān)的HLA-B27檢測(cè)體系，并對(duì)這兩種檢測(cè)體系的參數(shù)特征進(jìn)行了試驗(yàn)比較，從試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果可以看到，在檢測(cè)范圍上，兩個(gè)體系均具有較寬的線性范圍；靈敏度高，SYBR體系可以達(dá)到102copies/tube[20]。

馬志超等人采用的實(shí)時(shí)熒光PCR（熒光染料法），使用的染料是一種新型染SuperGreen，相比之前所講的SYBRGreen，大大提高了信號(hào)強(qiáng)度。在結(jié)果的判定上，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)更加直觀，可以實(shí)現(xiàn)直接從曲線圖來(lái)判斷是否陽(yáng)性。之前用過(guò)的PCR-SSP法，三年的平均陽(yáng)性率為33.3%，而該研究所采用的方法陽(yáng)性率為45%，進(jìn)一步揭示熒光PCR法的特異性和靈敏度比PCR-SSP法更高[19]。該技術(shù)與流式細(xì)胞術(shù)兩者均能夠準(zhǔn)確、可靠地檢測(cè)人類白細(xì)胞抗原―B27，但相對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)而言，前者的優(yōu)點(diǎn)是能夠識(shí)別出雙陽(yáng)性結(jié)果[21]。

相比之前的檢測(cè)方法，高的靈敏度，簡(jiǎn)單的操作，相對(duì)低廉的試劑等成為實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的一大特點(diǎn)，更適合于檢測(cè)大樣本，有利于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室之間數(shù)據(jù)的橫向比較。具有極好的臨床應(yīng)用價(jià)值和前景。

3 HLA-B27檢測(cè)結(jié)果對(duì)于強(qiáng)直性脊柱炎診斷的意義

骶髂關(guān)節(jié)是強(qiáng)脊炎最初敏感的部位，放射性檢查是診斷的關(guān)鍵，但恰恰有些患者患有背痛，但無(wú)經(jīng)典的放射學(xué)特征，使得醫(yī)生無(wú)法確診，延誤治療時(shí)間；還有些患者因?yàn)檠础⒊拷┒结t(yī)院看病，經(jīng)腰椎CT檢查診斷為“腰椎間盤(pán)突出癥”，便習(xí)以為常地認(rèn)為CT診斷已經(jīng)明了，可以確診，誰(shuí)曾想，原來(lái)部分強(qiáng)直性脊柱炎的病人可并發(fā)腰椎間盤(pán)突出癥，壓迫神經(jīng)引起疼痛，因此錯(cuò)失最佳治療機(jī)會(huì)。如果不能做到及時(shí)地控制病情，那么往往造成很嚴(yán)重的后果。不僅失去日常的工作能力，同時(shí)還會(huì)對(duì)家庭造成很大的影響與負(fù)擔(dān)。早期診斷尤為重要，可以減少疾病的發(fā)展機(jī)會(huì)，降低致殘率，提高愈后質(zhì)量。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療可以有效地降低致殘率。在國(guó)外AS的診斷上根據(jù)患者身體疼痛的情況和HLA-B27陽(yáng)性等特點(diǎn)，為風(fēng)濕病專科醫(yī)師提供診斷依據(jù)[22]。

對(duì)于一個(gè)漫長(zhǎng)，復(fù)雜，隱匿的疾病來(lái)說(shuō)，想要對(duì)病后進(jìn)行預(yù)測(cè)是不簡(jiǎn)單的。還好的是，強(qiáng)直性脊柱炎不會(huì)影響到患者的生命，對(duì)于愈后來(lái)說(shuō)也頗為良好。只有及早地發(fā)現(xiàn)、治療與控制病程，才能更好的提高治愈后的生命質(zhì)量，擁有陽(yáng)光的生活。由此同時(shí)，HLA-B27檢測(cè)還可以預(yù)防AS，對(duì)B27陽(yáng)性患者的一級(jí)親屬進(jìn)行檢測(cè)，倘若陽(yáng)性，也可盡早的診斷，為此進(jìn)行早干預(yù)早治療，減輕病情[23]。

隨著我們對(duì)研究的深入，將更全面地了解AS的發(fā)病機(jī)制，繼而為AS的治療提供依據(jù)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展及對(duì)此機(jī)制的不斷深入，AS的治療可推向更廣闊的領(lǐng)域[24]。

4 總結(jié)與展望

強(qiáng)直性脊柱炎是一種慢性炎癥性疾病，是由多因素多水平共同參與的。目前依然無(wú)法證實(shí)該病發(fā)生的確切病因。但該病與HLA-B27有極強(qiáng)的相關(guān)性，給診斷疾病帶來(lái)了新的曙光。本文詳盡地闡明了臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)HLA-B27基因檢測(cè)手段的歷史進(jìn)展過(guò)程，毫無(wú)疑問(wèn)，一項(xiàng)準(zhǔn)確便捷的檢驗(yàn)手段對(duì)該病的治療將起到至關(guān)重要的作用。

當(dāng)然，科技的進(jìn)步不會(huì)止步于當(dāng)下，隨著其他理念和技術(shù)的不斷革新，筆者有理由相信，將會(huì)有更多圍繞強(qiáng)直性脊柱炎的基因被發(fā)現(xiàn)，加之對(duì)HLA-B27基因更加深入的了解，將會(huì)形成一個(gè)多基因全方位的評(píng)估檢驗(yàn)體系，屆時(shí)將會(huì)出現(xiàn)更準(zhǔn)確快捷診斷疾病的方法，既減輕了醫(yī)務(wù)工作者的負(fù)擔(dān)，同時(shí)也給患者帶來(lái)福音。