從OPG-RANKL破骨細(xì)胞調(diào)控通路和Wnt成骨細(xì)胞調(diào)控通路探討“腎主骨”的性別差異及其機(jī)制*

付小衛(wèi)，宋長(zhǎng)恒，張治國(guó)，于 崢，劉 紅，潘靜華，李 艷，王少君，汪文來(lái)，李岳澤，吳佳瑩，趙宏艷，劉梅潔，鞠大宏△

(1．陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 712046; 2．中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

從OPG-RANKL破骨細(xì)胞調(diào)控通路和Wnt成骨細(xì)胞調(diào)控通路探討“腎主骨”的性別差異及其機(jī)制*

付小衛(wèi)1，宋長(zhǎng)恒2，張治國(guó)2，于 崢2，劉 紅2，潘靜華2，李 艷2，王少君2，汪文來(lái)2，李岳澤2，吳佳瑩2，趙宏艷2，劉梅潔2，鞠大宏2△

(1．陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 712046; 2．中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

目的:從OPG-RANKL破骨細(xì)胞調(diào)控通路和Wnt成骨細(xì)胞調(diào)控通路的角度，部分揭示“腎主骨”的性別差異及其機(jī)制。方法:選用同齡雌、雄SD大鼠160只，雌雄各半，共分為雌雄空白對(duì)照組、雌雄假手術(shù)組、OVX組、ORX組、E2組、T組、雌雄左歸丸組、雌雄右歸丸組12組，并采用卵巢切除和睪丸切除的方法制作腎虛OP動(dòng)物模型。在去勢(shì)后10 d，各給藥組開始灌胃給予相應(yīng)的藥物，每天1次，連續(xù)6 d，休息1d后再連續(xù)給藥6 d，如此給藥3個(gè)月。給藥結(jié)束后，將各組大鼠處死取雙側(cè)脛骨進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。結(jié)果:左歸丸對(duì)OVX大鼠OP具有明顯療效，而對(duì)ORX大鼠OP沒(méi)有療效;右歸丸對(duì)OVX大鼠和ORX大鼠OP雖均有明顯療效，但對(duì)OVX大鼠的療效要明顯優(yōu)于ORX大鼠。左歸丸能使OVX大鼠骨髓中RANKL蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，而使OPG蛋白表達(dá)顯著上調(diào);同時(shí)使Wnt1和β-catenin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，而左歸丸對(duì)ORX大鼠的以上指標(biāo)無(wú)明顯影響。右歸丸對(duì)OVX大鼠骨髓中OPG、RANKL以及Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)的作用與左歸丸的相同，只是右歸丸的作用強(qiáng)度要明顯大于左歸丸。右歸丸能使ORX大鼠骨髓中RANKL以及Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，但對(duì)OPG蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，并對(duì)RANKL、Wnt1和βcatenin的作用要明顯弱于對(duì)OVX大鼠的作用。結(jié)論:“腎主骨”存在性別差異，OPG-RANKL破骨細(xì)胞調(diào)控通路和Wnt成骨細(xì)胞調(diào)控通路發(fā)生不同改變，是造成這種差異的機(jī)制之一。

腎主骨;OPG-RANKL破骨細(xì)胞調(diào)控通路;Wnt成骨細(xì)胞調(diào)控通路

“腎主骨”是中醫(yī)的重要理論之一，是中醫(yī)治療骨質(zhì)疏松癥(OP)的主要理論基礎(chǔ)。長(zhǎng)期大量的臨床實(shí)踐表明，依據(jù)該理論進(jìn)行遣方用藥能取得較好的臨床療效。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，男女陰陽(yáng)稟賦相異，生長(zhǎng)壯老發(fā)展的各個(gè)階段皆有不同，這就造成男女之間在生理和病理上存在明顯差異。“腎主骨”是否也存在性別差異，若存在其機(jī)制如何?對(duì)此本實(shí)驗(yàn)采用卵巢切除(OVX)和睪丸切除(ORX)大鼠作為腎虛OP動(dòng)物模型，從OPG-RANKL破骨細(xì)胞調(diào)控通路和Wnt成骨細(xì)胞調(diào)控通路的角度，探討“腎主骨”的性別差異及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取9周齡SPF級(jí)SD大鼠160只，雌雄各半，雄鼠體質(zhì)量250～270 g，雌鼠體質(zhì)量200～220 g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK(軍)2007-004)，飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK (京)2010-0032)。

1.1.2 藥物 左歸丸藥液由熟地24 g、山藥12 g、枸杞子12 g、山萸肉12 g、川牛膝9 g、莬絲子12 g、龜板膠12 g、鹿角膠12 g組成，常規(guī)水煎制成濃度為0.968 g生藥/ml的藥液。右歸丸藥液由熟地24 g、山藥12 g、山茱萸9 g、枸杞子9 g、鹿角膠12 g、菟絲子12 g、杜仲12 g、當(dāng)歸9 g、肉桂6 g、制附子6 g組成，常規(guī)水煎制成濃度為1.024 g生藥/ml的藥液。以上中藥均經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所生藥室鑒定。

戊酸雌二醇1 mg/片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司產(chǎn)品(批號(hào)234A)，臨用時(shí)將其碾碎后用純凈水制成濃度為0.0092 mg/ml的混懸液。甲睪酮5 mg/片，上海信誼康捷藥業(yè)有限公司產(chǎn)品(批號(hào)110801)，臨用時(shí)將其碾碎后用純凈水制成濃度為0.092 mg/ml的混懸液。

1.1.3 主要試劑及儀器 大鼠骨保護(hù)素(OPG);細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配基(RANKL);Wnt1和 β-catenin抗體，美國(guó) SANTA CRUZ公司產(chǎn)品(批號(hào) F1813、E1613、B0113、G1813);山羊超敏二步法檢測(cè)試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司進(jìn)口分裝(批號(hào)K133312D)。

CRYOTOME FSE冰凍切片機(jī)，美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品;Reicheit-Jung 2040切片機(jī)、DM6000 B顯微鏡、Qwin Pro V3.5.0圖像分析系統(tǒng)，德國(guó)Leica公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 將160只同齡SD大鼠，根據(jù)性別按體質(zhì)量分為6組，其中雌性空白對(duì)照組和雄性空白對(duì)照組各12只，雌性假手術(shù)組和雄性假手術(shù)組各12只，雌性造模組和雄性造模組各56只。按照文獻(xiàn)［1］方法切除雌性造模組大鼠的雙側(cè)卵巢，按照文獻(xiàn)［2］方法切除雄性造模組大鼠的雙側(cè)睪丸。雌性假手術(shù)組和雄性假手術(shù)組的手術(shù)過(guò)程同上，但不摘除卵巢或睪丸。以上雄性假手術(shù)組有1只、造模組雌、雄性大鼠因手術(shù)各有3只于當(dāng)天死亡。

在術(shù)后10 d，再將兩造模組大鼠以體質(zhì)量按隨機(jī)數(shù)字表法分為OVX組13只，ORX組14只，戊酸雌二醇組(E2組)14只，甲睪酮組(T組)13只，雌性左歸丸組13只，雄性左歸丸組13只，雌性右歸丸組13只，雄性右歸丸組13只共8組。分組后開始對(duì)各給藥組大鼠灌胃給藥，雌、雄左歸丸組大鼠分別給予濃度為0.968 g生藥/ml的左歸丸藥液，給藥體積為1 ml/100 g體質(zhì)量，給藥劑量為9.68 g生藥/kg體質(zhì)量;雌、雄右歸丸組大鼠給予濃度為1.024 g生藥/ml的右歸丸藥液，給藥體積為1 ml/100 g體質(zhì)量，給藥劑量為10.24 g生藥/kg體質(zhì)量;E2組大鼠給予濃度為0.0092 mg/ml的戊酸雌二醇藥液，給藥體積為1 ml/100 g體質(zhì)量，給藥劑量為0.092 mg/kg體質(zhì)量;T組大鼠給予濃度為0.092 mg/ml的甲睪酮藥液，給藥體積為1 ml/100 g體質(zhì)量，給藥劑量為0.92 mg/kg體質(zhì)量。以上各組給藥劑量均為成人臨床用量的6.5倍，雌雄空白對(duì)照組、雌雄假手術(shù)組、OVX組、ORX組大鼠按上法灌服等體積的純凈水。以上給藥、給水每天1次，連續(xù)6 d，休息1 d后再連續(xù)給藥6 d，如此給藥3個(gè)月。每周稱重1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量。在給藥過(guò)程中，雌性右歸丸組和雄性左歸丸組各有1只大鼠因灌胃操作不慎死亡。

各組大鼠分別于處死前16 d和前3 d腹腔注射鹽酸四環(huán)素(劑量為30 mg/kg體質(zhì)量)，對(duì)骨組織進(jìn)行熒光標(biāo)記。給藥結(jié)束后，將大鼠以45 mg/kg體質(zhì)量劑量的戊巴比妥鈉腹腔注射進(jìn)行麻醉，然后迅速處死取右側(cè)脛骨，用4%多聚甲醛固定制作不脫鈣骨切片，用于骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的檢測(cè);取左側(cè)脛骨制作脫鈣骨冰凍切片，用于骨髓中 OPG、RANKL、Wnt1和β-Catenin蛋白表達(dá)的檢測(cè)。

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè) 1)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)測(cè)定:取右側(cè)脛骨塑料包埋，用2040切片機(jī)縱向切取5 μm不脫鈣骨切片，共制作2張，一張用甲苯胺藍(lán)染色，另一張則直接用于熒光觀察。采用Qwin Pro V3.5.0圖像分析系統(tǒng)，按照國(guó)際骨形態(tài)計(jì)量參數(shù)測(cè)量定義和計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)，取大鼠脛骨骨骺線1 mm下，對(duì)不脫鈣骨切片進(jìn)行形態(tài)計(jì)量［3-4］。①靜態(tài)參數(shù)。骨小梁體積百分比(TBV%):骨小梁體積占被測(cè)骨髓腔總體積的百分比，是反映骨量多少的重要指標(biāo);骨小梁吸收表面百分比(TRS%):不規(guī)則﹑凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比，它可反映破骨細(xì)胞活性;骨小梁形成表面百分比(TFS%):有成骨細(xì)胞被覆的類骨質(zhì)表面占骨小梁表面的百分比，它可判斷成骨細(xì)胞活性;骨丟失率= (某只大鼠脛骨TBV% －同性別空白對(duì)照組脛骨TBV%平均值)/同性別空白對(duì)照組脛骨TBV%平均值×100%。骨丟失率為正值時(shí)，表示骨量增加，絕對(duì)值越大表示骨量增加越多;為負(fù)值時(shí)，表示骨量丟失，絕對(duì)值越大表示骨量丟失越多。②動(dòng)態(tài)參數(shù)。骨小梁礦化率(MAR):骨小梁表面四環(huán)素?zé)晒怆p標(biāo)記帶平均距離/2次標(biāo)記相隔的天數(shù)，反映骨小梁骨礦化速度;骨皮質(zhì)礦化率(mAR):皮質(zhì)內(nèi)表面四環(huán)素?zé)晒怆p標(biāo)記帶平均距離/2次標(biāo)記相隔的天數(shù)，反映皮質(zhì)骨礦化速度。

2)OPG、RANKL、Wnt1及－catenin蛋白表達(dá)的檢測(cè):取大鼠左側(cè)脛骨近端1/3去除周圍軟組織，用4%多聚甲醛(0.01M PBS配制，pH 7.3，含1‰DEPC)固定;置于4℃冰箱48 h后，用0.01 M PBS (pH7.3，含1‰DEPC)充分洗滌骨組織，然后放入10%EDTA·Na20.01 M PBS(pH7.3，含1‰DEPC)中脫鈣。置于4℃冰箱每天換液1次。脫鈣結(jié)束后，用1‰DEPC水配制的0.01M PBS充分洗滌骨組織，隨后浸入15%蔗糖，4℃冰箱保存。用冷凍切片機(jī)切取6 μm厚的縱向脫鈣骨切片，貼于經(jīng)1%多聚賴氨酸涂片的載玻片上，－20℃冰箱保存待測(cè)。

按照所附說(shuō)明書采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)大鼠脛骨骨髓中OPG、RANKL、Wnt1及-catenin蛋白的表達(dá)。結(jié)果判斷，骨髓中陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色。采用Qwin Pro V3.5.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，隨機(jī)檢測(cè)骨骺線1 mm下髓腔內(nèi)5個(gè)以上高倍視野(×400)，計(jì)算每個(gè)視野的陽(yáng)性面積比，取其平均值。陽(yáng)性面積比為每個(gè)視野內(nèi)胞漿著色呈棕黃色的陽(yáng)性細(xì)胞面積占視野內(nèi)骨髓腔面積的百分比，以其作為陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞密度(簡(jiǎn)稱陽(yáng)性密度)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，若數(shù)據(jù)為正態(tài)分布則采用單因素方差分析;方差齊性組間兩兩比較采用 LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett’s T3(3)檢驗(yàn)。若數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis單因素方差分析(k樣本)(W)進(jìn)行處理;組間兩兩比較，采用其項(xiàng)下的Stepwise step-down檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 左、右歸丸對(duì)不同性別去勢(shì)大鼠脛骨骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的影響

2.1.1 左、右歸丸對(duì)不同性別去勢(shì)大鼠脛骨TBV%及骨丟失率的影響 表1顯示，OVX組以及雌性各給藥組大鼠脛骨TBV%均顯著低于雌性假手術(shù)組;與OVX組比較，E2組、雌性左歸丸組和右歸丸組的 TBV%均顯著增加;雌性右歸丸組的TBV%明顯高于雌性左歸丸組。與此相應(yīng)，OVX組以及雌性各給藥組大鼠脛骨骨丟失率(絕對(duì)值，下同)較雌性假手術(shù)組均顯著增加;與OVX組比較，E2組、雌性左歸丸組和右歸丸組的骨丟失率均顯著減少;雌性右歸丸組的骨丟失率較雌性左歸丸組明顯減少。與雄性假手術(shù)組比較，ORX組以及雄性各給藥組的TBV%均顯著減少;與ORX組比較，T組和雄性右歸丸組的TBV%顯著增加，而雄性左歸丸組的無(wú)顯著性變化，雄性右歸丸組的TBV%顯著高于雄性左歸丸組。與此相應(yīng)，與雄性假手術(shù)組比較，ORX組以及雄性各給藥組的骨丟失率均顯著增加;與ORX組比較，T組和雄性右歸丸組的骨丟失率顯著減少，而雄性左歸丸組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;雄性右歸丸組的骨丟失率顯著低于雄性左歸丸組。ORX組的TBV%顯著高于OVX組，其骨丟失率顯著低于OVX組;雄性左歸丸組與雌性左歸丸組比較TBV%差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但骨丟失率顯著增加;雄性右歸丸組與雌性右歸丸組比較TBV%差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但骨丟失率亦顯著增加。

表1 各組大鼠脛骨TBV%和骨丟失率的變化

表2 各組大鼠脛骨TRS%、TFS%及其TRS/TFS變化比較

2.1.2 左、右歸丸對(duì)不同性別去勢(shì)大鼠脛骨TRS%、TFS%及TRS/TFS比值的影響

表2顯示，與雌性假手術(shù)組比較，OVX組和雌性左歸丸組的TRS%、TFS%及其TRS/TFS均顯著增加，而E2組和雌性右歸丸組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;E2組、雌性左歸丸組和右歸丸組TRS%、TFS%及其TRS/TFS均顯著低于OVX組;雌性右歸丸組的以上3個(gè)指標(biāo)較雌性左歸丸組均明顯減少。除T組外，ORX組、雄性左歸丸組和右歸丸組的TRS%、TFS%及其TRS/TFS較雄性假手術(shù)組均顯著增加;與ORX組比較，T組、雄右歸丸組的TRS%、TFS%及其TRS/TFS均顯著減少，而雄性左歸丸組無(wú)顯著性變化;雄性右歸丸組的以上3個(gè)指標(biāo)均低于雄性左歸丸組。ORX組的TRS%、TFS%及其TRS/TFS均明顯低于OVX組;雄性左歸丸組的TRS%、TFS%及其TRS/TFS均明顯高于雌性左歸丸組;雄性右歸丸組以上3個(gè)指標(biāo)均明顯高于雌性右歸丸組。

2.1.3 左、右歸丸對(duì)不同性別去勢(shì)大鼠脛骨MAR和mAR的影響 表3顯示，OVX組、雌性左歸丸組大鼠脛骨MAR及mAR較雌性假手術(shù)組均顯著增加，E2組、雌性右歸丸組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;E2組、雌性左歸丸組和右歸丸組的 MAR及mAR均顯著低于OVX組;雌性右歸丸組的MAR及mAR較雌性左歸丸組顯著減少。ORX組、雄性左歸丸組和右歸丸組的MAR及mAR均高于雄性假手術(shù)組，而T組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與ORX組比較，除雄性左歸丸組外，T組和雄性右歸丸組的MAR及mAR均顯著減少;雄性右歸丸組的MAR及mAR低于雄性左歸丸組。ORX組的MAR、mAR較OVX組顯著減少;雄性左歸丸組的MAR、mAR顯著高于雌性左歸丸組;雄性右歸丸組顯著高于雌性右歸丸組。

表3 各組大鼠脛骨MAR及mAR的變化

圖1 各組大鼠脛骨骨髓OPG蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度變化

圖2 各組大鼠脛骨骨髓RANKL蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度變化

2.2 左、右歸丸對(duì)不同性別去勢(shì)大鼠脛骨骨髓中OPG、RANKL蛋白表達(dá)及其比值-RANKL/OPG的影響

2.2.1 左、右歸丸對(duì)不同性別去勢(shì)大鼠脛骨骨髓中OPG蛋白表達(dá)的影響 圖1顯示，與雌性假手術(shù)組、OVX組、雌性左歸丸組大鼠脛骨骨髓中OPG蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度顯著降低，而雌性右歸丸組、E2組的陽(yáng)性密度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與OVX組比較，E2組、雌性左歸丸組和右歸丸組的OPG蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度均顯著增高;雌性右歸丸組的OPG蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度明顯高于雌性左歸丸組。除T組外，ORX組、雄性左歸丸組和右歸丸組的OPG蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度均低于雄性假手術(shù)組;與ORX組比較，T組的OPG蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度顯著增高，而雄性左歸丸組和右歸丸組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;雄性右歸丸組與雄性左歸丸組比較OPG蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ORX組的OPG蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度明顯高于OVX組;雄性左歸丸組明顯低于雌性左歸丸組，雄性右歸丸組明顯低于雌性右歸丸組。

2.2.2 左、右歸丸對(duì)不同性別去勢(shì)大鼠脛骨骨髓中RANKL蛋白表達(dá)以及RANKL/OPG比值的影響 圖2、3顯示，OVX組和雌性左歸丸組大鼠脛骨骨髓中RANKL蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度以及RANKL/ OPG比值較雌性假手術(shù)組均顯著升高，而E2組和雌性右歸丸組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;E2組、雌性左歸丸組和右歸丸組RANKL蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度以及RANKL/OPG比值均顯著低于OVX組;雌性右歸丸組較雌性左歸丸組明顯降低。與雄性假手術(shù)組比較，ORX組、雄性左歸丸組和右歸丸組RANKL蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度以及RANKL/OPG比值均顯著升高，而T組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與ORX組比較，T組和雄性右歸丸組RANKL蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度以及RANKL/OPG比值顯著下降，而雄性左歸丸組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;雄性右歸丸組明顯低于雄性左歸丸組。ORX組的RANKL蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度以及RANKL/OPG比值較OVX組明顯降低;雄性左歸丸組較雌性左歸丸組明顯增高，雄性右歸丸組較雌性右歸丸組也明顯增高。

圖3 各組大鼠脛骨骨髓RANKL/OPG比值的變化

2.3 左、右歸丸對(duì)不同性別去勢(shì)大鼠脛骨骨髓中Wnt1和-catenin蛋白表達(dá)的影響

2.3.1 左、右歸丸對(duì)不同性別去勢(shì)大鼠脛骨骨髓中Wnt1蛋白表達(dá)的影響 圖4顯示，與雌性假手術(shù)組比較，OVX組、雌性左歸丸組大鼠脛骨骨髓中Wnt1蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度顯著增高，而E2組、雌性右歸丸組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;E2組、雌性左歸丸組和右歸丸組的Wnt1蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度均顯著低于OVX組;雌性右歸丸組明顯低于雌性左歸丸組。ORX組、雄性左歸丸組和右歸丸組Wnt1蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度均顯著高于雄性假手術(shù)組，而T組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;T組、雄性右歸丸組Wnt1蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度較ORX組顯著降低，而雄性左歸丸組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;雄性右歸丸組較雄性左歸丸組顯著降低。雄性左歸丸組與雌性左歸丸組、雄性右歸丸組與雌性右歸丸組比較，Wnt1蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度均明顯增高，ORX組顯著低于OVX組。

圖4 各組大鼠脛骨骨髓Wnt1蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度變化

2.3.2 左、右歸丸對(duì)不同性別去勢(shì)大鼠脛骨骨髓-catenin蛋白表達(dá)的影響圖5顯示，OVX組和雌性左歸丸組大鼠脛骨骨髓中-catenin蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度較雌性假手術(shù)組顯著增高，而E2組和雌性右歸丸組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;E2組、雌性左歸丸組和右歸丸組-catenin蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度較OVX組均顯著降低;雌性右歸丸組明顯低于雌性左歸丸組。與雄性假手術(shù)組比較，ORX組、雄性左歸丸組和右歸丸組-catenin蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度皆顯著增高，而T組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與ORX組比較，T組和雄性右歸丸組-catenin蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度顯著降低，而雄性左歸丸組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ORX組-catenin蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度顯著低于OVX組，雄性左歸丸組明顯高于雌性左歸丸組，雄性右歸丸組明顯高于雌性右歸丸組。

圖5 各組大鼠脛骨骨髓-catenin蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度變化

雌、雄假手術(shù)組與其各自空白對(duì)照組比較，上述指標(biāo)均未發(fā)生顯著性變化，從而排除了手術(shù)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OVX組和ORX組大鼠脛骨TBV%均顯著低于各自的假手術(shù)組，與之相應(yīng)，兩者的骨丟失率均顯著高于各自的假手術(shù)組;ORX組的TBV%顯著高于OVX組，骨丟失率則顯著低于OVX組。這一結(jié)果說(shuō)明，去勢(shì)均可造成骨量丟失并發(fā)生OP;但雌性大鼠丟失的骨量要明顯多于同齡的雄性大鼠，表明去勢(shì)所導(dǎo)致的骨量丟失存在著性別差異。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示，在OVX組和ORX組TBV%較各自假手術(shù)組減少的同時(shí)，兩者反映骨吸收的指標(biāo)TRS%、TRS/TFS以及反映骨形成的指標(biāo)TFS%、MAR、mAR均顯著增加。這一結(jié)果表明，OVX和ORX所造成的均是高轉(zhuǎn)換型的OP，即骨吸收與骨形成均增加，但由于骨吸收大于骨形成，而導(dǎo)致骨量丟失發(fā)生OP。骨形成是以骨吸收為前提的，去勢(shì)所導(dǎo)致的骨形成增加是一種代償性增加，如果骨吸收得到了抑制，骨形成也就隨之降低。不同性別大鼠去勢(shì)雖均可導(dǎo)致高轉(zhuǎn)換型的OP，但也存在著性別差異，表現(xiàn)在ORX組的TRS%、TRS/TFS以及TFS%、MAR、mAR均顯明低于OVX組，其中TRS/ TFS能反映骨轉(zhuǎn)換的程度，代表骨轉(zhuǎn)換率。這表明ORX所造成的高轉(zhuǎn)換程度要明顯低于OVX所造成的程度，即兩者在高轉(zhuǎn)換程度上存在性別差異。

OPG-RANKL-RANK是調(diào)控破骨細(xì)胞(OC)分化和功能的重要通路［5］。各種骨吸收刺激因子作用于成骨細(xì)胞(OB)和骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSC)，使其表達(dá)RANKL，RANKL與OC前體細(xì)胞和OC表面上的RANK結(jié)合，從而促進(jìn)OC的分化、成熟和激活，引起骨吸收;而OB和MSC又可分泌OPG，其與RANK競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL，阻止RANKL與RANK之間的結(jié)合，抑制OC的分化、成熟，從而防止骨的過(guò)度吸收［6-8］。由此可以看出，RANKL與OPG共同調(diào)控著OC的功能，使之發(fā)揮正常功能;若兩者發(fā)生異常改變，就可能使OC的功能發(fā)生異常。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與各自的假手術(shù)組比較，OVX組和ORX組大鼠脛骨骨髓中RANKL蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度均顯著增高，而OPG蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度均顯著降低，兩者的比值-RANKL/OPG均顯著增加。與OVX組比較，ORX組的RANKL蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度明顯降低，OPG蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度明顯增高，RANKL/OPG明顯降低。這一結(jié)果表明，OVX和ORX均可使RANKL蛋白表達(dá)上調(diào)，而使OPG蛋白表達(dá)下調(diào)。這是它們均可導(dǎo)致OP發(fā)生的共同機(jī)制之一，但也存在著性別差異，表現(xiàn)在ORX所造成的RANKL蛋白表達(dá)上調(diào)以及OPG蛋白表達(dá)下調(diào)的程度均不如OVX所造成的程度。這就是為什么雌性大鼠丟失骨量要明顯多于同齡雄性大鼠的原因之一。

Wnt信號(hào)途徑是細(xì)胞發(fā)育和調(diào)節(jié)生長(zhǎng)的一個(gè)關(guān)鍵途徑，在OB的定向分化、發(fā)育、增殖中起著關(guān)鍵性作用，是非常重要的骨代謝調(diào)控通路［9］。Wnt1和-catenin是其中的關(guān)鍵因子，它們表達(dá)增強(qiáng)可促進(jìn)OB的定向分化、發(fā)育和增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OVX組和 ORX組大鼠脛骨骨髓中 Wnt1和 -catenin陽(yáng)性密度均顯著高于各自的假手術(shù)組;而ORX組Wnt1和-catenin陽(yáng)性密度均低于OVX組。這一結(jié)果表明，OVX和ORX均可導(dǎo)致 Wnt1/-catenin OB調(diào)控通路功能上調(diào)，使骨形成增加，但ORX所造成的上調(diào)幅度要低于OVX所造成的幅度。這是OVX和ORX均可導(dǎo)致骨形成增加的共同機(jī)制之一，但也存在著性別差異，即ORX增加的程度要低于OVX增加的程度。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與OVX組比較，雌性左歸丸組和雌性右歸丸組大鼠脛骨TBV%均顯著增加，骨丟失率均顯著減少，同時(shí)大鼠脛骨TRS%、TRS/TFS以及TFS%、MAR、mAR均顯著減少，雌性右歸丸組與雌性左歸丸組比較，TBV%明顯增加，骨丟失率顯著減少，而TRS%、TRS/TFS以及TFS%、MAR、mAR均顯著減少。以上結(jié)果表明，左、右歸丸均能抑制OVX所致骨的高轉(zhuǎn)換，使骨吸收和骨形成均降低并提高骨量，而對(duì)OP均具有治療作用;但右歸丸的療效要明顯優(yōu)于左歸丸。對(duì)于ORX所致OP大鼠，右歸丸對(duì)上述指標(biāo)也能產(chǎn)生同樣的效應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到治療作用;但左歸丸無(wú)此效應(yīng)，因而也就無(wú)治療作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與雌性左歸丸組比較，雄性左歸丸組的骨丟失率、TRS%、TRS/TFS以及TFS%、MAR、mAR均顯著增加;與雌性右歸丸組比較，雄性右歸丸組的以上指標(biāo)也出現(xiàn)相同結(jié)果。這一結(jié)果表明，左歸丸、右歸丸在治療OP方面存在性別差異，表現(xiàn)在左歸丸對(duì)OVX大鼠OP具有明顯的治療作用，而對(duì)ORX大鼠OP無(wú)治療作用;右歸丸對(duì)OVX大鼠OP和ORX大鼠OP雖均有治療作用，但對(duì)前者的療效要明顯優(yōu)于對(duì)后者的療效。

中醫(yī)理論認(rèn)為“腎主骨”，腎精充實(shí)，骨髓化生有源，骨得其養(yǎng)則堅(jiān)固有力;若腎精虧虛，骨髓化生乏源，骨失其養(yǎng)，就會(huì)出現(xiàn)骨脆易折、腰背疼痛等癥狀，即是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所說(shuō)的OP。因此，“補(bǔ)腎”是治療OP的基本法則。左歸丸與右歸丸出自古代著名醫(yī)家張景岳的《景岳全書》。左歸丸具有滋補(bǔ)腎陰的功效，右歸丸具有溫補(bǔ)腎陽(yáng)的功效。OVX和ORX所造成的是腎虛OP模型?；谝陨险J(rèn)識(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)說(shuō)明，“腎主骨”存在著性別差異。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與OVX組比較，雌性左歸丸組和右歸丸組大鼠脛骨骨髓中的OPG蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度均顯著增高，而RANKL蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度、RANKL/OPG比值以及Wnt1和-catenin蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度均顯著降低;雌性右歸丸組的OPG蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度明顯高于雌性左歸丸組，而RANKL蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度、RANKL/OPG比值以及Wnt1和-catenin蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度均低于雌性左歸丸組。這一結(jié)果說(shuō)明，左、右歸丸均可通過(guò)對(duì)OPG-RANKL破骨細(xì)胞調(diào)控通路以及Wnt成骨細(xì)胞調(diào)控通路的調(diào)節(jié)而達(dá)到治療OVX大鼠OP的作用。表現(xiàn)在使OPG蛋白表達(dá)上調(diào)，使RANKL、Wnt1和-catenin蛋白表達(dá)下調(diào)，從而使骨吸收與骨形成均降低，抑制骨的高轉(zhuǎn)換，使骨吸收與骨形成達(dá)到相對(duì)平衡狀態(tài)，從而防止骨量的丟失。這是左、右歸丸均能治療OVX大鼠OP的共同機(jī)理之一，所不同的是右歸丸對(duì)上述指標(biāo)的作用強(qiáng)度要大于左歸丸。這也是右歸丸對(duì)OVX大鼠OP治療效果優(yōu)于左歸丸的機(jī)理之一。

與ORX組比較，雄性左歸丸組和右歸丸組的OPG蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;但雄性右歸丸組的RANKL蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度、RANKL/ OPG比值以及Wnt1和-catenin蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度均顯著降低，而雄性左歸丸組以上指標(biāo)均無(wú)顯著性變化。與雄性左歸丸組比較，雄性右歸丸組OPG的蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度無(wú)顯著性變化，但RANKL蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度、RANKL/OPG比值以及Wnt1和-catenin蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度均顯著降低。這一結(jié)果說(shuō)明，右歸丸對(duì)ORX大鼠骨髓中的OPG雖無(wú)明顯作用，但可通過(guò)下調(diào)RANKL、Wnt1和-catenin蛋白表達(dá)來(lái)達(dá)到治療OP的作用。左歸丸對(duì)以上指標(biāo)均未產(chǎn)生明顯影響，所以對(duì)ORX大鼠OP無(wú)治療作用。

與雌性右歸丸組比較，雄性右歸丸組的OPG蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度降低，而RANKL蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度、RANKL/OPG比值以及Wnt1和-catenin蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度均顯著增高;與雌性左歸丸組比較，雄性左歸丸組的以上指標(biāo)也發(fā)生同樣的變化。通過(guò)這一結(jié)果，并結(jié)合同性別組間比較結(jié)果可以得到以下結(jié)論:右歸丸對(duì)OVX大鼠OP的治療效果之所以優(yōu)于其對(duì)ORX大鼠的治療效果，是由于以下兩個(gè)原因:①右歸丸不僅能使OVX大鼠骨髓中OPG蛋白表達(dá)上調(diào)，而且還能使RANKL、Wnt1和-catenin蛋白表達(dá)下調(diào)，而右歸丸對(duì)ORX大鼠骨髓中OPG蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，而只能使RANKL、Wnt1和-catenin蛋白表達(dá)下調(diào);②右歸丸雖均能使OVX大鼠和ORX大鼠骨髓中的RANKL、Wnt1和-catenin蛋白表達(dá)下調(diào)，但對(duì)前者的作用強(qiáng)度要明顯大于對(duì)于后者。左歸丸能使OVX大鼠骨髓中OPG蛋白表達(dá)上調(diào)，而使RANKL、Wnt1和-catenin蛋白表達(dá)下調(diào)，而對(duì)ORX大鼠骨髓中的這些指標(biāo)均未產(chǎn)生明顯影響，所以左歸丸對(duì)OVX大鼠OP有效，而對(duì)ORX大鼠OP無(wú)效。

綜上所述，“腎主骨”存在性別差異，OPGRANKL破骨細(xì)胞調(diào)控通路和Wnt成骨細(xì)胞調(diào)控通路發(fā)生不同改變，是造成這種差異的機(jī)制之一。

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表2 各組大鼠血清、BALF中IL-4水平變化(±s)

表2 各組大鼠血清、BALF中IL-4水平變化(±s)

注:與空白組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;與模型組比較:●P＜0.05，●●P＜0.01

組別 鼠數(shù) IL-4(ng/L)血清BALF空白組模型組羅 氟 司 特 組蘇 子 降 氣 組QZZF小 劑 量 組QZZF中 劑 量 組QZZF大 劑 量 組10 10 10 10 10 10 10 3.62±0.18 4.71±1.19▲▲3.60±0.31●●3.53±0.61●●4.12±0.94●3.94±0.51●●4.02±0.37●3.46±0.20 3.84±0.58▲3.57±0.22 3.48±0.17●3.68±0.20 3.48±0.16●●3.66±0.14

中醫(yī)學(xué)雖無(wú)“慢性阻塞性肺疾病”的病名，根據(jù)臨床表現(xiàn)及發(fā)病特點(diǎn)，多屬于“咳嗽”“痰飲”“肺脹”等范疇，其病理特征為本虛標(biāo)實(shí)，正氣虛弱為本，痰飲、血瘀、氣滯等為標(biāo)。芪蛭皺肺顆粒是我們基于COPD的病機(jī)特點(diǎn)所擬定的治療方劑，具有益氣培元、活血化瘀、癟皺肺脹之功用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芪蛭皺肺顆粒能夠降低COPD模型大鼠血清及BALF中 IL-4表達(dá)，升高動(dòng)脈血?dú)庵?pH、PaO2、SaO2，降低PaCO2含量，并可能存在一定的量效關(guān)系。表明通過(guò)調(diào)節(jié)血清及BALF中IL-4表達(dá)水平，減輕氣道炎癥浸潤(rùn)，可能是提高肺通氣和肺換氣能力，增加血液中O2含量，減少CO2潴留，調(diào)節(jié)血液的酸堿平衡，從而干預(yù)COPD的發(fā)生發(fā)展。

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收稿日期:2015-04-12

R285．5

B

1006-3250(2016) 01-0066-07

2015-05-12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81273889)

付小衛(wèi)(1978-)，男，陜西咸陽(yáng)人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)藥痹癥的臨床與基礎(chǔ)研究。

△通訊作者:鞠大宏(1963-)，男，遼寧鳳城人，研究員，博士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)痹癥的臨床與基礎(chǔ)研究，E-mail: judahong@sohu．com。