脾虛證糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型的建立及評(píng)價(jià)*

王寧丁，劉曉秋，伍軍軍，陳 嘉，周錢(qián)糧，陳英杰，張永斌△

(1．廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 510405;2．廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，廣州 510405; 3．廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510405)

脾虛證糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型的建立及評(píng)價(jià)*

王寧丁1，劉曉秋2，伍軍軍1，陳 嘉1，周錢(qián)糧1，陳英杰3，張永斌1△

(1．廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 510405;2．廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，廣州 510405; 3．廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510405)

目的:建立帶有脾虛證的糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法:采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)結(jié)合30%乙醇灌胃的方法建立糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型，通過(guò)大鼠宏觀(guān)表征采集、血糖監(jiān)測(cè)、抓力測(cè)定、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、爪和尾的RGB值等進(jìn)行脾虛證的診斷及考證。結(jié)果:第4～10周模型組大鼠持續(xù)消瘦，拉力測(cè)定值降低，曠場(chǎng)活動(dòng)減弱，舌質(zhì)變淡，爪和尾的r值降低，排便次數(shù)增加，糞便變軟或便溏，83%的模型動(dòng)物出現(xiàn)糖尿病疾病特征、氣虛證1項(xiàng)和脾的組織定位體征1項(xiàng)以上指征。結(jié)論:腹腔注射STZ結(jié)合30%乙醇灌胃的方法成功建立糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型，并發(fā)現(xiàn)建模后第4～10周可能為糖尿病大鼠脾虛證的時(shí)間窗。

糖尿病大鼠;胃黏膜損傷;脾虛證;動(dòng)物模型

糖尿病(diabetes mellitus，DM)已經(jīng)成為繼心腦血管疾病和癌癥的世界第三重大疾?。?］，糖尿病并發(fā)癥是決定糖尿病患者預(yù)后的最主要因素，已成為世界性難題。DM屬于中醫(yī)消渴病范疇，近現(xiàn)代大量研究表明［2-4］，脾虛乃糖尿病的發(fā)病之本，也是糖尿病的中醫(yī)病機(jī)，而DM胃腸病變是其最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。為規(guī)范1型糖尿病胃黏膜損傷模型建立，并對(duì)病證結(jié)合動(dòng)物模型進(jìn)行研究，本實(shí)驗(yàn)采用STZ腹腔注射加30%乙醇灌胃的方法，誘發(fā)1型糖尿病動(dòng)物胃黏膜損傷模型，動(dòng)態(tài)觀(guān)察動(dòng)物臨床癥狀、血糖、體質(zhì)量等，并根據(jù)中醫(yī)理論模擬臨床望、聞、問(wèn)、切和辨證方法，對(duì)糖尿病大鼠的宏觀(guān)表征和行為學(xué)變化進(jìn)行評(píng)價(jià)，確定糖尿病大鼠脾虛證出現(xiàn)的時(shí)間窗，為病證結(jié)合研究并指導(dǎo)臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑

雄性SPF級(jí)SD大鼠73只，體質(zhì)量260～280 g，購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2008-0020)。STZ(Sigma公司)、穩(wěn)毫型血糖試紙(強(qiáng)生上海醫(yī)療器材公司)、檸檬酸(廣州醫(yī)藥站化學(xué)試劑綜合公司)、檸檬酸三鈉(成都化學(xué)試劑廠(chǎng))。

1.2 分組及造模

SD大鼠造模前測(cè)體質(zhì)量和血糖，經(jīng)禁食不禁水12 h后按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組(29只)和模型組(44只)。模型組動(dòng)物腹腔注射1%STZ溶液(用0.1 mol/L，pH4.2的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液配制成10 g/L的溶液)，劑量5.5 ml/kg，正常組大鼠腹腔注射0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液5.5 ml/kg。注射STZ 72 h后監(jiān)測(cè)隨機(jī)血糖，連續(xù)3次血糖值≥16.8 mmol/L，且有多飲、多尿、多食癥狀入選糖尿病動(dòng)物模型。造模同時(shí)每周大鼠灌胃30%乙醇1次，劑量10 ml/kg，連續(xù)4周。觀(guān)察16周動(dòng)態(tài)采集糖尿病大鼠的宏觀(guān)表征，第16周末取胃組織做病理切片，HE染色觀(guān)察其病理變化。

1.3 體質(zhì)量、攝食量、飲水量和尿量

每周稱(chēng)量動(dòng)物體質(zhì)量，每月2組動(dòng)物各取6只做代謝籠監(jiān)測(cè)，記錄動(dòng)物24 h飲水量、食料量和尿量。體質(zhì)量用以判斷其陰盛衰度，食量用以判斷脾胃、胃氣及相關(guān)病證，飲水量用以判斷寒熱、陰陽(yáng)及相關(guān)病證，每2周測(cè)量1次，連續(xù)16周。

1.4 計(jì)算爪、尾RGB值

在相同光照下，相機(jī)放大3倍拍攝大鼠左后爪和尾，記錄爪、尾詳細(xì)外觀(guān)及紅色程度，相片用PhotoShop7.0圖像軟件進(jìn)行圖像處理，選取爪的掌部和尾中部作為RGB色度的定量分析，R代表紅色，G代表綠色，B代表藍(lán)色，計(jì)算出反映爪和尾紅色程度r值，r=R/(R+G+B)，每2周拍攝1次，連續(xù)16周。

1.5 抓力測(cè)定實(shí)驗(yàn)

毛巾放置在平臺(tái)上并與電子拉力計(jì)相連，將大鼠放置毛巾上并向后拉，大鼠前肢由于本能反應(yīng)會(huì)抓住毛巾，前爪松開(kāi)毛巾時(shí)的拉力即大鼠的最大抓力。抓力值用于判斷氣盛衰度，每2周測(cè)量1次，連續(xù)16周。

1.6 曠場(chǎng)試驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)所用敞箱為立方形，高40 cm，長(zhǎng)寬均為50 cm，底面分成面積相等的25塊。以大鼠穿越的格子數(shù)作為水平活動(dòng)得分，動(dòng)物穿越1格為1次，如動(dòng)物沿線(xiàn)行走每10 cm為1次。以直立次數(shù)為垂直活動(dòng)得分，雙前肢離地為1次。每只動(dòng)物測(cè)試1次，每次3 min。敞箱測(cè)試中的水平活動(dòng)得分反映大鼠的活動(dòng)度，垂直活動(dòng)得分反映大鼠對(duì)周?chē)挛锏呐d趣高低，每2周測(cè)量1次，連續(xù)16周。

1.7 脾虛證判定標(biāo)準(zhǔn)

參考1987年衛(wèi)生部藥政局頒布的《中藥治療脾虛證的臨床研究指導(dǎo)原則》和湯家銘主編的《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》，從大鼠的表征推斷脾虛證證候疾病診斷依據(jù):隨機(jī)血糖≥16.8 mmol/L;證候診斷依據(jù):氣虛證如乏力、疲倦、活動(dòng)減少、曠場(chǎng)活動(dòng)減弱和舌胖大邊有齒痕等;脾的組織定位體征如乏力、懶動(dòng)、肌體萎軟不用、消瘦、枯槁無(wú)澤、食欲不振、大便異常、腹部脹滿(mǎn)、肛門(mén)污穢等。動(dòng)物模型具備:疾病診斷依據(jù)+氣虛證1項(xiàng)+脾的組織定位體征1項(xiàng)以上即可。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物建模情況

表1、2顯示，模型組大鼠出現(xiàn)多飲多食多尿且體型消瘦的“三多一少”特征，30%乙醇灌胃4周后，模型動(dòng)物糞便逐漸變稀、肛周污穢。結(jié)合血糖監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，已建立較穩(wěn)定的糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型。觀(guān)察到第4周時(shí)，糖尿病模型的成模率為75%，基本與文獻(xiàn)報(bào)道相近。觀(guān)察至第16周時(shí)，糖尿病胃腸損傷模型的成模率為61.4%。

表1 2組大鼠血糖、體質(zhì)量、食量、飲水量和尿量比較

表2 SD大鼠成模率與死亡率(只)

2.2 爪和尾的RGB值

表3顯示，正常組大鼠舌質(zhì)淡紅，略暗潤(rùn)澤，反映大鼠紅色度的r值處于正常范圍;模型組大鼠舌質(zhì)偏淡，舌胖大邊有齒痕，爪略顯干，尾顯蒼白，r值從第4周起明顯降低，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。

2.3 抓力測(cè)定結(jié)果

表3顯示，正常組大鼠抓力隨日齡增加而有所變化，但變化比較平緩;模型組動(dòng)物注射STZ后開(kāi)始消瘦、蜷縮，第4周起抓力明顯小于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3顯示，正常組大鼠活動(dòng)正常，模型組動(dòng)物第4周后在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱里縮懶動(dòng)，對(duì)周?chē)挛锱d趣度降低，穿格次數(shù)與直立次數(shù)均少于正常組，第4周、第6周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，P＜0.01)。

表3 2組大鼠抓力、爪及尾RGB值和曠場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果

2.5 大鼠胃黏膜病理染色結(jié)果

圖1顯示，正常組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞連續(xù)性好，黏膜層次結(jié)構(gòu)清楚，黏膜肌層和黏膜下層未見(jiàn)毛細(xì)血管擴(kuò)張瘀血。模型組大鼠胃黏膜層上皮細(xì)胞黏液變薄、缺失、細(xì)胞間隙變大，有輕度的壞死，胞漿有空泡變形成，毛細(xì)血管可見(jiàn)有擴(kuò)張和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 2組大鼠胃黏膜病理組織圖(HE染色×100)

2.6 初步確定糖尿病大鼠脾虛證時(shí)間窗

模型組大鼠腹腔注射STZ 72 h后，隨機(jī)血糖普遍升高并出現(xiàn)糖尿病疾病特征，第2周起部分模型大鼠開(kāi)始消瘦，活動(dòng)減少，體質(zhì)量下降，毛色枯槁無(wú)澤，排便次數(shù)增加;第4～10周模型組大鼠持續(xù)消瘦，拉力測(cè)定值降低，曠場(chǎng)活動(dòng)減弱，舌質(zhì)變淡，爪和尾的r值降低，排便次數(shù)增加，糞便變軟或便溏，83%的模型動(dòng)物出現(xiàn)糖尿病特征、氣虛證1項(xiàng)和脾的組織定位體征1項(xiàng)以上指征，初步辨證為脾虛證，因此腹腔注射STZ后第4～16周應(yīng)為糖尿病大鼠脾虛證的時(shí)間窗。

3 討論

糖尿病屬于中醫(yī)“消渴”范疇。中醫(yī)的證是臨床生理或病理變化的客觀(guān)反映，其生理或病理變化是可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)來(lái)表達(dá)的。目前多數(shù)病證結(jié)合模型的造模及評(píng)價(jià)方法將證候和疾病人為分開(kāi)，兩套方法、兩種標(biāo)準(zhǔn)整合在同一動(dòng)物上。雖然這種評(píng)價(jià)方法是現(xiàn)在最常用也是有一定根據(jù)和理論支撐的，但這種方法常常是證候指標(biāo)和病理指標(biāo)的簡(jiǎn)單相加，將病證結(jié)合模型中證候和疾病的關(guān)聯(lián)性忽視了。尋找中醫(yī)證候與疾病病理狀態(tài)關(guān)聯(lián)性大的檢測(cè)指標(biāo)，將有利于中醫(yī)證候的客觀(guān)化。如馮博等［5］探討了胰升血糖素樣肽-1(GLP-1)與糖尿病脾虛證的關(guān)系;龔燕冰等［6］總結(jié)了內(nèi)皮素、脂質(zhì)、免疫系統(tǒng)、性激素、垂體-腎上腺軸激素、NO、酪氨酸蛋白激酶(Ins-RTPK)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白細(xì)胞素-6(IL-6)等與糖尿病證候的關(guān)系，但中醫(yī)證候本身的復(fù)雜性決定了證候與客觀(guān)指標(biāo)之間不可能存在線(xiàn)性關(guān)系，該類(lèi)研究存在一定的局限性。

本研究在“有病便是有證”思想指導(dǎo)下，在未疊加其他證候造模因素條件下，利用STZ誘發(fā)雄性SD大鼠脾虛證1型糖尿病模型，并結(jié)合30%乙醇灌胃促進(jìn)糖尿病大鼠胃黏膜損傷的發(fā)生，利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)評(píng)價(jià)方法，計(jì)量化中醫(yī)四診信息并做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，篩選出穩(wěn)定的疾病動(dòng)物模型，分別進(jìn)行基本宏觀(guān)表征、特性宏觀(guān)表征的動(dòng)態(tài)采集及行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè);臨床癥狀與動(dòng)物表征的等效轉(zhuǎn)化并做證候?qū)傩宰R(shí)別;微觀(guān)理化指標(biāo)病理切片檢測(cè)、確定了1型糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型脾虛證的時(shí)間窗。該項(xiàng)研究體現(xiàn)了中醫(yī)思想并為糖尿病動(dòng)物模型和中醫(yī)證候研究提供了一定的背景資料。

［1］田婷，馬向華，沈捷．2型糖尿病動(dòng)物模型研究概況［J］．醫(yī)學(xué)綜述，2011(6):905-908．

［2］潘善余．糖尿病從脾論治探討［J］．浙江中醫(yī)雜志，2004，39 (1):6-7．

［3］陳長(zhǎng)青，熊曼琪，李賽美．消渴病(糖尿病)的病機(jī)研究進(jìn)展［J］．中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2002(10):72-74．

［4］賀文廣，楊競(jìng)，鐘麗紅．楊競(jìng)從脾論治糖尿病的經(jīng)驗(yàn)［J］．上海中醫(yī)藥雜志，2005，39(3):27-28．

［5］馮博，孫豐雷，徐學(xué)敏．淺探胰升血糖素樣肽-1水平與糖尿病脾虛證的關(guān)系［J］．江蘇中醫(yī)藥，2012(11):7-9．

［6］龔燕冰，高思華，倪青．糖尿病中醫(yī)證候的微觀(guān)機(jī)制探析［J］．中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2007，14(5):94-96．

Establishment and evaluation of gastric mucosal damage model in diabetic rats with spleen deficiency syndrome

WANG Ning-ding1，LIU Xiao-qiu2，WU Jun-jun1，CHEN Jia1，ZHOU Qian-liang1，CHEN Ying-jie3，ZHANG Yong-bin1△
(1．Laboratory Animal Research Center，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China; 2．Pi-Wei Institute，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China; 3．First Clinical Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China)

Objective:The research aimed to observe and evalute the damage model of gastric mocosa in diabetic rats with spleen deficiency．Method:The damage model of gastric mucosa in diabetic rat produced by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ)in combination with 30%ethanol．Through macroscopic characterization of acquisition in rats，blood sugar monitoring，holding power measurement，open-field test and the claws and tail of the RGB values to diagnosis and evaluate spleen-deficiency syndrome．Result:Observed 4thto 10thweeks，the study found that rats in model group continuous thin，tension values were lower，open-field activities were weaken，tongue nature turn light，the RGB values of claws and tail were lower，increase of the times．of stool and change to soft or loose，and 83%of the animal model appeared diabetes disease characteristics，one deficiency syndrome，and the organization of the spleen positioning signs 1 or more indications．Conclusion:The damage model of diabetic rat gastric mucosa could be successfully induced by intraperitoneal injection method of STZ in combination with ethanol，and the time window for the appearance of spleen deficiency was 4-10 weeks．

diabetic rat gastric mucosal injury;Spleen deficiency syndrome; Animal model

R-587．1

A

1006-3250(2016)01-0038-03

2015-02-20

廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(2010B060500013，2011B060300007);國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201310572021)

王寧丁(1990-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，從事人類(lèi)疾病模型建立及藥效的臨床與研究。

△通訊作者:張永斌，男，副研究員，醫(yī)學(xué)博士，E-mail:zyb-73 @163．com。