一點紅中總生物堿的提取與測定方法研究

陳燕婷　黃銳濤　陳光孝　紀敏琳　胡文海　姜　濤（吉林大學珠海學院珠海519041）

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一點紅中總生物堿的提取與測定方法研究

陳燕婷黃銳濤陳光孝紀敏琳胡文海姜濤*（吉林大學珠海學院珠海519041）

摘要：目的：探討超聲波法和索式提取法對一點紅中總生物堿的最佳工藝條件與測定方法的研究。方法：以紫外分光光度法為測定方法，一點紅中總生物堿提取來量為考察目標，采用正交實驗法優(yōu)化提取工藝。結果：不同溫度、不同濃度、提取時間對一點紅總生物堿提取量有顯著影響。提取次數(shù)影響不大。結論：超聲波法的提取最佳工藝為80℃下以物料比為1∶40對一點紅生物堿類物質(zhì)進行30min提取，得出提取率為0.435%，索式提取法的提取最佳工藝為用80%的乙醇對一點紅生物堿類物質(zhì)進行2h提取，得出提取率為0.320%。通過兩種方法的比較，一點紅總生物堿的提取為超聲波法更優(yōu)。

關鍵詞：一點紅生物堿超聲波法索式提取法正交設計

一點紅Emilia sonehifolia DC．，又名羊蹄草、紅背葉、葉下紅、紅背果等，菊科一點紅屬一年生或多年生草本，分布于我國華南、華中和西南等地。一點紅性味涼，具有清熱解毒、活血散淤之功，臨床上常用于治療上呼吸道感染、口腔潰瘍、肺炎、乳腺炎、癤腫瘡瘍、皮膚濕疹等[1，2]。已報道該植物地上部分含有吡咯雙烷類生物堿和黃酮類化合物，還含有植物甾醇、脂肪酸等化學成分[3]。由于化學活性尚未明確，故需通過不同方法測定一點紅總生物堿含量從而控制原材藥的質(zhì)量。

1　材料與方法

1.1實驗材料與儀器：紫外可見分光光度計（日本島津）；超聲波發(fā)聲儀（AS7240ADT）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀）；索式提取器（上海BOMEX-250）；電加熱套（DHT型攪拌調(diào)溫電熱套）?？鄥A對照品（中國藥品生物制品檢定所）；乙醇；氯仿等試劑均為分析純。

1.2波長的選擇：分別取苦參堿對照品液、一點紅總生物堿樣品液適量，加入溴麝香草酚藍顯色劑10mL，密塞，劇烈振搖2min提取，靜置2h，分取氯仿層。以未加樣液的氯仿顯色層作為參比在400～800nm范圍內(nèi)進行光譜掃描，結果苦參堿對照品液和一點紅樣品液均在414nm波長處有最大吸收，故測定時選用此波長。

1.3標準曲線的繪制：精密稱取苦參堿對照品4.2mg，加入氯仿定容至100mL，即得溶液濃度為42μg/mL苦參堿標準儲備液。準確稱取溴麝香草酚藍31.25mg，置250mL量瓶中，加配置好的pH=7.6磷酸二氫鉀緩沖溶液至刻度，搖勻即得。然后取7個10mL的容量瓶，分別用移液槍精密吸取苦參堿標準儲備液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于容量瓶中，加入氯仿至刻度，搖勻顯色；以第一管未加苦參堿的氯仿層作空白對照，在414nm處測各苦參堿對照品的吸光度值。以苦參堿對照品濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度值為縱坐標，得到標準曲線的回歸方程為Y= 0.0416x+0.0014，R2=0.9977。

1.4索氏提取法提取生物堿的含量測定：稱取4份同批一點紅藥粉各5g于4個索式提取器中，分別加入60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇各100mL進行水浴回流（提取2次，每次提取1h），合并提取液；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，揮干溶劑得到生物堿粗提取物浸膏[4，8]。浸膏加水熱熔并加2%鹽酸溶解，調(diào)節(jié)ph值為2～3，減壓抽濾；濾液用氯仿萃取至氯仿層無色，棄去氯仿層，水層用10%氨水調(diào)節(jié)pH值為9～11，用氯仿萃取，精密吸取續(xù)濾液1mL至10mL容量瓶中，加氯仿至刻度[5]。最后精取10mL樣液至分液漏斗，加入溴麝香草酚藍顯色劑20mL，密塞，劇烈振搖2min，然后靜置2h后分取氯仿層，備用。

1.5超聲波法提取生物堿的含量測定：按正交實驗法[6]對超聲提取法提取工藝條件進行優(yōu)選，分別對不同溫度40℃、60℃、80℃，不同時間20min、30min、40min，不同物料比1∶30、1∶40、1∶50進行優(yōu)化條件的選擇。其具體方法是分別取一點紅全草粗粉1g，置具塞錐形瓶中，加濃氨水4滴，精密加入氯仿40mL，然后置于超聲波容器內(nèi)，按不同的條件進行實驗，待溶液冷卻后補足失重，濾過，精密吸取續(xù)濾液1mL用氯仿定容至10mL備用。精取10mL樣液至分液漏斗，加入溴麝香草酚藍顯色劑20mL，密塞，劇烈振搖2min，然后靜置2h后分取氯仿層，備用[7]。

1．6方法學考察

1．6．1精密度結果試驗分析：對苦參堿標準溶液（濃度為42μg/ mL）進行5次平行測定，測得5個吸光度值，計算RSD值為0.97%，結果顯示精密度良好。見表1。

表1　苦參堿標準溶液精密度試驗Table 1matrine standard solution precision test

1．6．2樣品的重復性考察：取同一批樣品，分別采用超聲波選擇條件為30min，80℃，料液比為1∶40；索式提取法選擇條件為80%乙醇提取，時間為2h進行3次平行測定。結果表明無論是索式提取法或超聲波法，重復性均很好，RSD<1%。見表2。

表2　超聲波法和索式提取法提取一點紅中總生物堿含量的重復性測定Table 2 repetitive determination of the total alkaloid content usingultrasonic extraction and soxhlet extraction in Emilia Sonehifolia

1．6．3穩(wěn)定性實驗考察：取供試品溶液顯色后于0，30min，60min，90min，120min，150min，180min進行吸光度測定。測定結果如下表所示，并計算得到RSD為0.38%（n=7）。結果顯示樣品溶液顯色后在120min內(nèi)測定穩(wěn)定。見表3。

表3　苦參堿標準溶液穩(wěn)定性試驗Table 3matrine standard solution stability test

1．6．4加樣回收試驗：取同一批已知含量的一點紅全草粗粉6份，分別精密加入苦參堿對照品液適量，混勻蒸干，按照樣品測定項下操作，測定含量，結果平均加樣回收率為93.55%，RSD＝3.459%（n＝6）。結果見表3。其中回收率=（測得量-樣品中含有的量）/加入對照品的量*100%。

表4　加樣回收率試驗Table 4 sample recovery rate test

2　實驗結果與討論

2.1生物堿含量和提取率計算：將各待測液測得的吸光度值代入上述回歸方程，計算出各待測液濃度，該濃度值即為生物堿含量，再根據(jù)稀釋倍數(shù)換算出一點紅提取物總生物堿含量，并得出其提取率。

一點紅總生物堿含量（mg/g）=（C供×D×V）/m

式中，C供為供試品濃度，D為稀釋濃度，V為樣品定容體積，m為樣品取樣重量。

2.2不同條件下索氏提取法測樣品含量的結果及討論：取“1.2”中的備用待測液2mL用氯仿定容至10mL，以未加待測液的氯仿做空白，在414nm處測吸光度，每組重復三次實驗算平均值，結果如下：

表5　索式提取法中不同濃度乙醇的結果對比Table 5 The result of different comparing concentration of ethanol by Soxhlet extraction

由表5中得知，索式提取法中最優(yōu)提取工藝應為用80%乙醇為提取溶劑對一點紅生物堿類進行提取。

2.3超聲波法對樣品含量的測定結果及討論：取“1.3”中各組備用待測液2mL，分別用氯仿定容至10mL，以未加待測液的氯仿做空白，在414nm處測吸光度，每組重復測三次結果求平均值，結果如下：

表6　超聲波法不同條件結果對比Table 6 The result of different conditions by ultrasonic extraction

由上表得：在A、B、C三個因素中，A因素中，因為K2＞K3＞K1，所以A因素中最佳的條件為超聲時間為30min，而B因素中，因為K3＞K2＞K1，所以B因素中最佳的條件為溫度為80℃，在C因素下，因為K1＞K2＞K3，所以C因素中最佳條件為料液比為1∶40g/mL。綜合以上因素，超聲波提取最佳條件為30min，80℃，料液比為1∶40。

3　結　論

通過本實驗可知超聲波法優(yōu)于索式提取法。索式提取法耗時長，藥品浪費較嚴重且提取含量較低。實驗采用超聲提取技術，不僅具有能耗低、效率高、不破壞有效成分的特點，利用超聲波產(chǎn)生的強烈振動、高加速度、空化效應、攪拌作用等，加速植物材料中的有效成分進入溶劑，從而增加有效成分的提取率，縮短提取時間，而且避免回流提取中高溫對提取成分的影響。

參考文獻

[1]胡忠澤，譚志靜，等.超聲波提取姜黃素最佳工藝研究[J]中國實驗方劑學雜志，2009，11（2）：6-7.

[2]劉厚誠.一點紅及其栽培技術[J].長江蔬菜，2002，11：12.

[3]高建軍，程東亮.一點紅化學成分的研究[J].中國中藥雜志，1993，18（2）：102.

[4]周吳萍，韋媛媛，李軍生，等.不同產(chǎn)地一點紅總生物堿的提取與分析[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19（7）：1593.

[5]彭拓華，鐘世順，張少俊，等.三種提取方法提取洋金花生物堿的比較研究[J].中成藥，2012，34（5）：832-835.

[6]滕海英，祝國強，黃平，等.正交實驗設計案例分析[J].藥學服務與研究，2008Feb：8（1）.

[7]周吳萍，韋媛媛，李軍生，等.廣西一點紅總生物堿的提取和抗菌活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19（8）：1835.

[8]陳月圓，李典鵬，高江林.黃柏中總生物堿的提取及測定方法研究[J].廣西植物，2003，23（6）：565-567.

致謝：感謝廣東省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（項目編號：201413684014）及吉林大學珠海學院第八批百人工程項目對本實驗提供資金贊助，也感謝吉林大學珠海學院所有指導和支持的老師們。

Extraction and Determ ination of Total Alkaloid about Em ilia Sonehifolia

Chen Yanting Huang Ruitao Chen Guangxiao Ji Minlin Hu Wenhai Jiang Tao*（Department of chemistry and pharmacy，ZhuHai College of JiLin University，ZhuHai，GuangDong，519041）

Abstract：Objective:discussing the optimum extraction conditions and determinationmethod of total alkaloid in Emilia Sonehifolia using themethod of ultrasonic extraction and soxhletextraction.Methods:use themethod of UV spectrophotometry to detect the contentof total alkaloid,to optimize the extraction process by orthogonal experimentmethod.Results:extraction quantity of total alkaloid has significant effect in the different temperature,ethanol concentration and extracting time.Conclusion:the best process of extraction was using 1:40 of material ratio for 30min under the 80℃in ultrasonic method，and extraction rate was 0.435%.the best process of extraction in soxhlet? extraction as follows:the duration of extraction was 2h with 80%ethanol，and extraction rate was 0.320%.Through the comparison of twomethods，we concluded that the bestmethod of extraction of total alkaloids in Emilia sonehifolia is ultrasonicmethod.

Key words:Emilia sonehifolia Alkaloid Ultrasonicmethod Soxhletextraction Orthogonal design

*通訊作者

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：B

文章編號：1672-8351（2016）01-0085-02