二穗短柄草細(xì)胞分裂素氧化酶BdCKX編碼基因的克隆及功能分析

李　嘉，周　雪，李婷婷，王中華，權(quán)　力

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

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二穗短柄草細(xì)胞分裂素氧化酶BdCKX編碼基因的克隆及功能分析

李嘉，周雪，李婷婷，王中華，權(quán)力

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

摘要：細(xì)胞分裂素是一類重要的植物激素，通過控制細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)促進(jìn)芽萌發(fā)生長(zhǎng)等方面控制植物發(fā)育。細(xì)胞分裂素的代謝主要通過細(xì)胞分裂素氧化酶來進(jìn)行，在作物性狀改良和抗旱品種培育方面具有重要的研究?jī)r(jià)值。為研究麥類作物細(xì)胞分裂素氧化酶功能，本實(shí)驗(yàn)采用同源克隆的方法，在二穗短柄草中獲得了一個(gè)與擬南芥細(xì)胞分裂素氧化酶基因AtCKX3高度同源的候選基因，命名為BdCKX。將該基因與pCXSN質(zhì)粒連接構(gòu)建植物超表達(dá)載體，并以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化二穗短柄草植物幼胚。所獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)遲緩，莖短，葉片小，地上部分變小。另外，組織表達(dá)譜分析表明BdCKX在二穗短柄草生長(zhǎng)發(fā)育的不同時(shí)期和不同組織中具有不同的表達(dá)模式，在生長(zhǎng)40天的植株葉片中表達(dá)量有明顯升高。由于細(xì)胞分裂素氧化酶編碼基因在早熟禾亞科物種中較為保守，本研究為理解麥類作物的發(fā)育調(diào)控機(jī)制和遺傳改良麥類作物生長(zhǎng)提供必要的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：二穗短柄草；CKX基因；超表達(dá)；細(xì)胞分裂素

干旱是造成農(nóng)作物減產(chǎn)甚至大面積死亡的主要自然災(zāi)害之一。據(jù)測(cè)算，全球每年因干旱造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)60～80億美元，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其它自然災(zāi)害[1]。因此，如何利用生物技術(shù)手段，從植物本身出發(fā)，揭示其抗旱特性，對(duì)于安全應(yīng)對(duì)糧食危機(jī)、實(shí)現(xiàn)水資源的合理利用和改善生態(tài)環(huán)境均有著重要意義[2-3]。培育抗旱品種的關(guān)鍵在于改良根系。在小麥的相關(guān)研究中有結(jié)果表明，縱深發(fā)達(dá)的根系系統(tǒng)可使植物充分吸收利用貯存在土壤中的水分，提高資源利用效率[4]。根系的生長(zhǎng)一方面受到環(huán)境的影響，另一方面也離不開內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)。作為一類重要的植物激素，細(xì)胞分裂素在調(diào)控根系的維管組織發(fā)育[5]、根細(xì)胞的生長(zhǎng)[6]、根系統(tǒng)的向地性[7]、不定根和側(cè)根的生長(zhǎng)發(fā)育[8]及根系分生組織活性[9]等多方面，均發(fā)揮著不可忽視的作用。

細(xì)胞分裂素的降解代謝主要依賴于細(xì)胞分裂素氧化酶(cytokinin oxidase，CKX)。CKX特異性地降解細(xì)胞分裂素N6位置的不飽和側(cè)鏈而使其徹底失去活性[10-11]，從而有效下調(diào)植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素水平，是植物維持體內(nèi)細(xì)胞分裂素動(dòng)態(tài)平衡的一種重要方式。有研究表明，在擬南芥中分別過量表達(dá)AtCKX家族基因，可使內(nèi)源細(xì)胞分裂素水平下調(diào)30%～45%，其中以AtCKX3的下調(diào)效果較為顯著[5]。在煙草中過表達(dá)AtCKX1基因，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因煙草根部鮮重增加約一半[12]。此外，有研究認(rèn)為OsCKX2是在水稻中控制穗粒數(shù)的主效基因，與擬南芥AtCKX2基因具有相似功能[13]。超表達(dá)ZmCKX基因的轉(zhuǎn)基因玉米在花粉或花藥專一啟動(dòng)子的控制下表現(xiàn)雄性不育[14]。在植物生長(zhǎng)的不同階段和不同部位CKX基因家族的表達(dá)模式也存在較大差異[15-16]。因此，CKX基因作為下調(diào)植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素水平的重要基因，在定向改良作物性狀、培育優(yōu)良品種方面具有值得發(fā)掘的研究潛力。

通過使用擬南芥AtCKX蛋白序列與二穗短柄草數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)二穗短柄草可能編碼10個(gè)CKX基因，但其相關(guān)功能未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過BLASTP比對(duì)以及蛋白序列分析結(jié)果，選擇了與AtCKX3蛋白序列相似度較高的BdCKX基因(基因序列號(hào)為Bradi1g37470)進(jìn)行功能研究。通過同源分子克隆獲得BdCKX基因并構(gòu)建植物超表達(dá)載體，繼而采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化模式植物二穗短柄草。同時(shí)，為解析BdCKX基因的工作模式，本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了BdCKX基因在二穗短柄草不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的組織表達(dá)譜。由于CKX基因在早熟禾亞科植物中相對(duì)比較保守，因此，本研究能夠豐富麥類作物品種改良的理論依據(jù)，為加快作物遺傳改良、培育抗旱型作物提供理論支持。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料及生長(zhǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)以二穗短柄草Bd21為材料，在22℃光照培養(yǎng)箱中采用長(zhǎng)光照進(jìn)行培養(yǎng)(16 h見光/8 h暗光)；所用土壤為通用的植物培養(yǎng)基質(zhì)；花盆規(guī)格為5.5 cm×5.5 cm×5.5 cm；pCXSN表達(dá)載體和農(nóng)桿菌EHA105由本實(shí)驗(yàn)室保存；RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)于TIANGEN(北京)公司，熒光定量試劑盒購(gòu)于Takara公司；引物由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成。

1.2研究方法

1.2.1BdCKX基因的序列分析相關(guān)的生物信息學(xué)分析工具如下：

BLASTP比對(duì)分析和序列來源(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)；

蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析(http://web.expasy.org/protparam/)；

蛋白質(zhì)保守域分析(http://smart.embl-heidelberg.de/)；

亞細(xì)胞定位(http://psort.hgc.jp/form.html)；

1.2.2BdCKX-pCXSN超表達(dá)載體構(gòu)建以AtCKX3蛋白序列為查詢序列，在phytozome 10.3(www.phytozome.net)中的二穗短柄草數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASP比對(duì)搜索。選擇同源性最高的Bradi1g37470基因作為研究候選基因，進(jìn)行同源克隆分析研究對(duì)象。借助Oligo 6 軟件設(shè)計(jì)引物，以二穗短柄草DNA為模板，使用Pfu DNA聚合酶擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 2 min；95℃ 30 s；57℃ 30 s；72℃ 2 min；33個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并純化回收目的片段，連接到pCXSN載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司測(cè)序驗(yàn)證后保存在-80℃冰箱，完成載體構(gòu)建。

1.2.3BdCKX基因的克隆及轉(zhuǎn)化為了進(jìn)一步驗(yàn)證BdCKX基因的生物學(xué)功能，本實(shí)驗(yàn)采用高保真酶擴(kuò)增得到全長(zhǎng)為1903 bp的BdCKX基因開放讀碼框的DNA片段(圖1)。連接pCXSN表達(dá)載體后，挑取單克隆送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)驗(yàn)證無(wú)誤后，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105菌株。

圖2BdCKX-pCXSN轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR驗(yàn)證

Fig.2Identification ofBdCKX-pCXSN transgenic plants by PCR

為了準(zhǔn)備侵染材料，我們?cè)跓o(wú)菌條件下使用解剖鏡挑取二穗短柄草幼胚，一個(gè)月后選擇黃色的愈傷塊繼代培養(yǎng)。待愈傷塊生長(zhǎng)至直徑約1 cm時(shí)與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，利用農(nóng)桿菌將目的基因?qū)攵攵瘫荨＾r(nóng)桿菌每侵染1次需要收集300個(gè)愈傷塊，共侵染4次。經(jīng)過潮霉素篩選抑制非陽(yáng)性愈傷的生長(zhǎng)，1個(gè)月后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱進(jìn)行生芽、生根培養(yǎng)。待組培苗高約5 cm時(shí)將叢生芽分離，分別移栽到育苗基質(zhì)中，放入恒溫光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。待組培苗成活后，提取葉片DNA，并用潮霉素(Hygromycin, Hyg)引物檢測(cè)，擴(kuò)增出1475 bp的片段(圖2)，確定為陽(yáng)性苗，可用于后續(xù)表型觀察。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR成熟二穗短柄草種子剝?nèi)シf殼后放于培養(yǎng)皿中，加入適量超純水，在4℃下靜置2 d。然后轉(zhuǎn)移到光照培養(yǎng)箱中，在22℃，18 h光照/6 h黑暗條件下萌發(fā)。待真葉長(zhǎng)出后，將幼苗插入漂浮板，置于裝有超純水的1 L燒杯中，培養(yǎng)條件不變。10 d后分別用剪刀收集葉片和根部材料，用錫箔紙包裹在液氮中速凍并于-80℃冰箱保存。同批余下幼苗則移栽到培植土中，第20天開始每隔10 d挖取部分植株，收集葉片和根部材料各3份作為生物學(xué)重復(fù)，保存于-80℃冰箱，直至第50天。

采用TaKaRa公司SYBRPremix Ex TaqTM(Perfect Real Time)熒光定量試劑盒，BIO-RAD CFX實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)BdCKX基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。以二穗短柄草Actin基因作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法，分析BdCKX基因在根與葉中不同時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量。

本研究所采用的引物序列及對(duì)應(yīng)基因見表1。

2結(jié)果分析

2.1BdCKX蛋白結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)

雖然不同來源的CKX蛋白結(jié)構(gòu)有差異, 但它們約有1/3的氨基酸序列高度保守。所以我們通過擬南芥AtCKX3蛋白序列在短柄草數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTP比對(duì)，選擇同源性較高的BdCKX，通過在線軟件分析蛋白結(jié)構(gòu)和預(yù)測(cè)蛋白功能。一級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明：BdCKX共有538個(gè)氨基酸殘基，其中正電荷氨基酸數(shù)為49，負(fù)電荷氨基酸數(shù)為55，分子質(zhì)量為58.3232 kD，理論等電點(diǎn)6.08，半衰期大于10 h。根據(jù)預(yù)測(cè)說明，不穩(wěn)定指數(shù)以40為界，大于40預(yù)測(cè)蛋白穩(wěn)定，小于40預(yù)測(cè)蛋白則不穩(wěn)定。BdCKX不穩(wěn)定指數(shù)為39.46，預(yù)測(cè)為不穩(wěn)定蛋白。

通過GOR4方法對(duì)BdCKX二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線分析，BdCKX的二級(jí)結(jié)構(gòu)以33.09%的α螺旋和50.37%的無(wú)規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)原件，延伸鏈較少，所占百分比為16.54%(表2)。由此推測(cè)，α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是BdCKX蛋白中最大量的結(jié)構(gòu)元件，延伸鏈散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。根據(jù)蛋白質(zhì)保守域分析結(jié)果，BdCKX具有保守的黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合域和細(xì)胞分裂素結(jié)合域，這是CKX家族共有的蛋白結(jié)構(gòu)特征。

應(yīng)用Psort工具對(duì)BdCKX進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果表明該蛋白可能定位于過氧化物酶體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，最有可能作為分泌蛋白定位于細(xì)胞外(表2)，這與BdCKX具有細(xì)胞分裂素氧化酶的功能這一假設(shè)是相吻合的。

磷酸化是生物體內(nèi)普遍的一種調(diào)節(jié)方式，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白調(diào)控中起到重要作用。根據(jù)Prosite Scan分析結(jié)果，BdCKX有蛋白酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)三類磷酸化位點(diǎn)，此外還有N-糖基化位點(diǎn)、N-豆蔻?；稽c(diǎn)、?；稽c(diǎn)、氧化還原酶類FAD共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)和Ribosomal protein S2 signature 1(表4)多種活性位點(diǎn)，為其發(fā)揮催化作用提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

2.2BdCKX組織表達(dá)譜分析

為了明確BdCKX基因在二穗短柄草不同生長(zhǎng)時(shí)期、不同生長(zhǎng)部位的表達(dá)特征，我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，分別檢測(cè)生長(zhǎng)時(shí)期為10 d、20 d、30 d、40 d、50 d的二穗短柄草地上部分和地下部分中BdCKX基因的表達(dá)量。結(jié)果表明(圖3)：在根中，BdCKX表達(dá)量較平穩(wěn)，且持續(xù)低于葉中的表達(dá)量；在葉中，前30天BdCKX表達(dá)量變動(dòng)不大，但是在第40天的樣本中，表達(dá)量顯著升高，相對(duì)表達(dá)量為3.77，與同期根部表達(dá)量的差值為3.55。在第50天的樣本中，根與葉中BdCKX的表達(dá)量基本一致。證明BdCKX在一定程度上參與二穗短柄草不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的特異性調(diào)節(jié)，并在根與葉中呈現(xiàn)一定差異。

2.3二穗短柄草BdCKX-pCXSN轉(zhuǎn)基因植株表型分析

與野生型植物對(duì)照相比，二穗短柄草轉(zhuǎn)BdCKX-pCXSN的陽(yáng)性植株有異常表現(xiàn)。在濾紙上萌發(fā)10 d的轉(zhuǎn)基因植株相比于對(duì)照，葉片變小，根部變短，植株整體較小(圖4a)。在育苗基質(zhì)中生長(zhǎng)40 d后，轉(zhuǎn)基因植株地上部分明顯小于對(duì)照，株高短，葉片少(圖4b)。說明在二穗短柄草根部與地上部的整體形態(tài)建成中，BdCKX起到了一定作用。

注：a.10天大小植物; b.40天大小植物。Note: a.10 days old seedlings; b.40 days old plants.

圖4BdCKX-pCXSN植株與對(duì)照表型比對(duì)

Fig.4Phenotype comparisons between the positiveBdCKX-pCXSN and the control plants

3討論

本研究從二穗短柄草中得到一個(gè)細(xì)胞分裂素氧化酶基因BdCKX的基因全長(zhǎng)，通過序列分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白含有多種催化功能所需的活性位點(diǎn)，且具有保守的黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合域和細(xì)胞分裂素結(jié)合域，有可能以分泌蛋白的形式發(fā)揮功能。這些結(jié)果表明，BdCKX作為CKX家族同源蛋白，有可能與其它CKX有著相似的結(jié)構(gòu)和功能，在內(nèi)源細(xì)胞分裂素的氧化降解方面發(fā)揮著一定作用。

組織表達(dá)譜分析結(jié)果表明：在二穗短柄草生長(zhǎng)發(fā)育的前30天BdCKX基因表達(dá)較平穩(wěn)，在第40天時(shí)葉部表達(dá)量明顯升高，同時(shí)根部表達(dá)量有所降低，這可能與細(xì)胞分裂素作為一種信號(hào)分子，在調(diào)控不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期植物不同生長(zhǎng)部位所起到的不同作用有關(guān)。2010年Werner等[12]通過轉(zhuǎn)擬南芥AtCKX1基因的煙草實(shí)驗(yàn)證明，細(xì)胞分裂素所調(diào)控的植物形態(tài)建成在一定程度上具有器官自主性，可能不受維管束長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)目刂朴绊?。因此，本研究所涉及的BdCKX基因，極可能是在植物生長(zhǎng)中期階段，大約40 d左右，在植物地上部分控制細(xì)胞分裂素代謝中起重要作用。由于二穗短柄草基因組編碼10個(gè)同源性各異的CKX基因，其它基因可能分別在其它時(shí)間和組織器官中發(fā)揮功能，對(duì)植株整體細(xì)胞分裂素的動(dòng)態(tài)平衡起調(diào)節(jié)作用。更深層次認(rèn)知二穗短柄草CKX的功能，其它同源基因的相關(guān)研究需要日后的工作來完善。

超表達(dá)BdCXK基因的植物個(gè)體表現(xiàn)出較為弱小的地上部分組織形態(tài)，是由于細(xì)胞分裂素能夠通過參與細(xì)胞分裂與分化過程調(diào)節(jié)植物地上部分的生長(zhǎng)發(fā)育。而過量的BdCKX表達(dá)產(chǎn)物增強(qiáng)了細(xì)胞分裂素的降解，降低了植物體內(nèi)的細(xì)胞分裂素含量，從而弱化了細(xì)胞分裂素對(duì)地上部分的促進(jìn)作用。這與擬南芥等植物中的研究發(fā)現(xiàn)類似，說明CKX基因的作用機(jī)制應(yīng)該在高等植物中是相對(duì)比較保守的。同時(shí)有分析發(fā)現(xiàn)，CKX基因在早熟禾亞科植物中都比較保守，且基因序列高度相似。鑒于CKX基因作用機(jī)理保守，可以通過生物技術(shù)手段，改造CKX基因的時(shí)空表達(dá)模式、表達(dá)強(qiáng)度等，達(dá)到有效調(diào)節(jié)麥類作物特定組織的內(nèi)源性細(xì)胞分裂素的分布及含量的目的。通過控制內(nèi)源細(xì)胞分裂素含量從而定向改良植物器官形態(tài)和功能，形成發(fā)達(dá)的根系或提高地上部分生物質(zhì)量等與產(chǎn)量相關(guān)的農(nóng)藝形狀，對(duì)于增強(qiáng)植物抗旱能力、促進(jìn)作物生產(chǎn)具有重要意義。

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Cloning and functional analysis of aBdCKXgene inBrachypodiumdistachyon

LI Jia, ZHOU Xue, LI Ting-ting, WANG Zhong-hua, QUAN Li

(CollegeofAgronomy,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Keywords:Brachypodiumdistachyon;CKX; overexpression; cytokinin

Abstract：As one of the most important plant hormones, cytokinin plays diverse roles during plant development including regulation of cell division, promotion of shoot growth etc. The metabolism of cytokinin is primarily dependent on functions of cytokinin oxidase encoding genes. To gain insightful understanding and take full advantage of cytokinin oxidase in the genetic improvement of crop growth traits, a homologous gene to theAtCKX3 (ArabidopsisCytokininOxidase3) gene inBrachypodiumdistachyon,BdCKX, was cloned. To elucidate its bioloical function, CDS sequence of theBdCKXgene was amplified and ligated with the pCXSN vector, which was then introduced to callus tissue of young embryo byAgrobacterium-mediated transformation for over-expression analysis. Positive transformants exhibited phenotypes including short stem, shrunk leaf, retarded development, and small overall shoot. It could be concluded that the elevated expression ofBdCKXgene was able to interfere plant growth through the degradation of endogenous cytokinin levels. In addition, gene expression profile indicated thatBdCKXwas differentially expressed in various tissues at different developmental stages. In particular, expression level ofBdCKXwas markedly shifted in leaf of 40 days old seedling. Because cytokinin encoding genes were conserved among Pooideae species, our research may provide a theoretical base for the regulatory mechanism and genetic improvement of Triticeae crops.

文章編號(hào)：1000-7601(2016)03-0261-06

doi:10.7606/j.issn.1000-7601.2016.03.41

收稿日期：2015-11-24

基金項(xiàng)目：陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014JQ3095)；陜西省遺傳育種新技術(shù)團(tuán)隊(duì)(2014KCT-25)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(Z109021426)

作者簡(jiǎn)介：李嘉(1990—)，內(nèi)蒙古包頭人，碩士，研究方向?yàn)樽魑锟购禉C(jī)理。 E-mail：jiamibaobi@126.com。 通信作者：權(quán)力，E-mail：lquan@nwafu.edu.cn。

中圖分類號(hào)：S336

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A