蘋(píng)果渣中蘋(píng)果多酚柱層析分離工藝研究

葛邦國(guó)　宋　燁

（中華全國(guó)供銷合作總社濟(jì)南果品研究院，山東濟(jì)南250014）

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蘋(píng)果渣中蘋(píng)果多酚柱層析分離工藝研究

葛邦國(guó)宋燁

（中華全國(guó)供銷合作總社濟(jì)南果品研究院，山東濟(jì)南250014）

摘要：本文研究了大孔吸附樹(shù)脂對(duì)蘋(píng)果渣中蘋(píng)果多酚純化和Sephadex凝膠對(duì)蘋(píng)果多酚的精制工藝參數(shù)，選定AB-8為純化用大孔吸附樹(shù)脂，采用70％乙醇作為解吸劑；Sephadex凝膠精制后的蘋(píng)果多酚，經(jīng)冷凍干燥，得到蘋(píng)果多酚粉末。蘋(píng)果多酚得率為0.12％，蘋(píng)果多酚的純度由初步純化的15.5％提高到75.6％。

關(guān)鍵詞：蘋(píng)果多酚；大孔樹(shù)脂；純化；精制

植物多酚的提取純化工藝，一般采用乙醇提取，真空濃縮，然后樹(shù)脂吸附進(jìn)行初步純化，但這種方法能耗高，過(guò)程長(zhǎng)，產(chǎn)品純度不高[1,2]。隨著功能成分提取技術(shù)的發(fā)展，多酚的提取純化更多的采用柱層析技術(shù)，使用大孔吸附樹(shù)脂和Sephadex凝膠，以提高產(chǎn)品純度[3,4]。近年來(lái)，大孔吸附樹(shù)脂在植物功能性成分提取純化中的研究和應(yīng)用日漸增多，顯示出了獨(dú)特的吸附和洗脫特性，這一技術(shù)既可提高樣品供試液純度，也可減少有毒有機(jī)溶劑的使用[5-7]。Sephadex凝膠屬于分子篩凝膠，具有分子篩特性，可按分子量大小分離物質(zhì)，適合于不同類型有機(jī)物的分離，性質(zhì)穩(wěn)定，易實(shí)施循環(huán)操作。本文研究了大孔吸附樹(shù)脂對(duì)蘋(píng)果渣中蘋(píng)果多酚純化和Sephadex凝膠對(duì)蘋(píng)果多酚的精制工藝參數(shù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用材料為經(jīng)微波法或超臨界二氧化碳提取得到的蘋(píng)果多酚粗提物。大孔吸附樹(shù)脂X-5、AB-8、NKA9、HD400，購(gòu)于天津南開(kāi)大學(xué)化工廠；Folin-Ciocalteu試劑，購(gòu)于Sigma公司；綠原酸、(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、p-香豆酸、槲皮素，咖啡酸、香草醛、阿魏酸、根皮苷、沒(méi)食子酸等物質(zhì)，均購(gòu)自于Sigma公司；其它試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

島津UVmini-1240紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本）；RE1002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，常州市國(guó)立試驗(yàn)設(shè)備研究所（中國(guó)）；2BV循環(huán)水式多用真空泵，北京融合立盛科技有限公司（中國(guó)）；HZX-HA型水浴恒溫振蕩器，金壇市精達(dá)儀器制造有限公司（中國(guó)）；LC2200S分析天平（德國(guó)）；TDL-5-A高速離心機(jī)，上海安亭儀器廠（中國(guó)）；層析柱（1.6cm×40cm)），無(wú)錫兆陽(yáng)化工裝備有限公司（中國(guó)）。

1.3蘋(píng)果多酚的測(cè)定

選擇Folin酚法測(cè)定蘋(píng)果多酚。酚類物質(zhì)的含量采用高效液相色譜測(cè)定，標(biāo)樣為綠原酸、(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、p-香豆酸、槲皮素，咖啡酸、香草醛、阿魏酸、根皮苷、沒(méi)食子酸。色譜分析條件：Kromasil C18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）和水（B）；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL；流速1.0mL/min。紫外檢測(cè)器檢測(cè)，波長(zhǎng)280nm。

表1　梯度洗脫條件

1.4大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理[8]

選取的四種大孔吸附樹(shù)脂分別用95％乙醇室溫浸泡24h后，裝柱，首先用95％乙醇洗滌，至流出溶液加水不呈白色混濁，再用蒸餾水脫除乙醇。接著用2BV的5％ HCl淋洗并浸泡4h，水洗至中性；再用2BV的2％NaOH溶液淋洗并浸泡4h，水洗至中性。

1.5Sephadex G25預(yù)處理

SephadexG25在使用之前將凝膠溶脹于層析溶劑中至少3h。先用2～3個(gè)柱體積的洗脫液進(jìn)行清洗。凝膠柱的填裝在保證膠粒不變形的前提下，應(yīng)在盡可能高的壓力下裝柱。將處理好的凝膠在燒杯內(nèi)用1倍體積的洗脫液攪拌成懸浮液，自柱頂部沿管內(nèi)壁緩緩加入柱。

1.6測(cè)定指標(biāo)及方法

樹(shù)脂的吸附量（mg/g）及解吸率（％）計(jì)算公式如下：

2　結(jié)果與分析

2.1大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附解吸試驗(yàn)

2.1.1大孔樹(shù)脂的篩選

準(zhǔn)確稱取已處理好的AB-8、X-5、HD400、NKA四種樹(shù)脂各2.0g于150mL三角瓶中，分別加入40mL 0.866mg/mL蘋(píng)果多酚提取液，置于水浴恒溫振蕩器上，40℃、150r/min振蕩，在1、2、3、4、5h設(shè)定時(shí)間取樣測(cè)定，以吸附量、時(shí)間作圖。

由圖1可知，HD400、NKA和X-5起始吸附能力較差，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸附量緩慢上升；AB-8起始吸附量較大，此后吸附量增加較快，在4～5h內(nèi)即可基本達(dá)到平衡。從圖中可看出，AB-8對(duì)蘋(píng)果多酚的吸附量和吸附速率都高于X-5、HD400和NKA。所以最終選定AB-8為純化用大孔吸附樹(shù)脂。

圖1　不同樹(shù)脂對(duì)蘋(píng)果多酚的吸附效果

2.1.2不同濃度乙醇對(duì)解吸效果的影響

對(duì)于蘋(píng)果多酚的解吸，從解吸能力、易于回收、節(jié)能、廉價(jià)和毒性角度來(lái)選擇適宜的解吸劑，綜合考慮，以醇類較佳。本研究選用乙醇作為解吸劑，通過(guò)靜態(tài)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定乙醇濃度。取充分吸附蘋(píng)果多酚后的AB-8樹(shù)脂1.0g，分別準(zhǔn)確加入30％、50％、70％、80％、90％乙醇各25mL，室溫靜置24h，過(guò)濾，檢測(cè)濾液中蘋(píng)果多酚的含量，根據(jù)濾液中多酚含量計(jì)算乙醇解吸能力，比較乙醇濃度對(duì)蘋(píng)果多酚解吸效果的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可以看出，隨著乙醇濃度的增加，樹(shù)脂的吸附能力越大，當(dāng)乙醇濃度大于70％時(shí)，樹(shù)脂吸附能力增幅不是很大，同時(shí)乙醇濃度越大，乙醇越容易蒸發(fā)，有安全隱患，因此本實(shí)驗(yàn)選用70％乙醇作為解吸劑，此時(shí)解吸率為85.68％。

表2　不同乙醇濃度對(duì)蘋(píng)果多酚的解析效果

2.1.3溫度對(duì)吸附性能的影響

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的AB-8樹(shù)脂5.0g，置于150mL三角瓶中，加入濃度為0.866mg/mL的蘋(píng)果渣提取液50mL，靜置4h，吸附溫度分別設(shè)定為20℃、30℃、40℃和50℃，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，溫度對(duì)吸附性能的影響很小，溫度30℃時(shí)吸附能力只比20℃提高5％，考慮到節(jié)能，故在室溫下進(jìn)行吸附即可。

圖2　溫度對(duì)吸附效果的影響

2.2AB-8大孔吸附樹(shù)脂動(dòng)態(tài)純化蘋(píng)果多酚工藝

稱取2.0g預(yù)處理好的AB-8樹(shù)脂，裝入2.0×40cm的玻璃層析柱中。將0.866mg/mL濃度的樣品放入樹(shù)脂，分段收集樣品，當(dāng)流出液濃度達(dá)上樣的1/5時(shí)，可認(rèn)為蘋(píng)果多酚已收集結(jié)束，停止進(jìn)樣，計(jì)算吸附量。

2.2.1粗提液濃度對(duì)樹(shù)脂吸附能力的影響

粗提的蘋(píng)果多酚，添加不同質(zhì)量的蒸餾水，進(jìn)行動(dòng)態(tài)樹(shù)脂吸附實(shí)驗(yàn)。若粗提液濃度小于0.5mg/mL，試驗(yàn)過(guò)程中，樹(shù)脂容易泄漏，部分樹(shù)脂未能完成吸收，從而影響樹(shù)脂的吸附能力；濃度大于1.5mg/mL，溶液出現(xiàn)絮狀沉淀，使樹(shù)脂堵塞，吸附能力下降。由圖3可以看出，當(dāng)濃度在1.1mg/mL時(shí)，樹(shù)脂的吸附能力最大。故上樣濃度控制在1.0mg/mL～1.3mg/mL范圍內(nèi)。

圖3　上樣濃度對(duì)吸附量的影響

2.2.2吸附流速對(duì)吸附能力的影響

研究不同吸附流速對(duì)樹(shù)脂吸附能力的影響，選擇流量分別為1、2、3、4BV/h，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，在1BV/h～4BV/h內(nèi)，隨著流速的增加，每毫升樹(shù)脂對(duì)蘋(píng)果多酚的吸附能力下降，但2BV/h較3BV/h、4BV/h下降速度慢，綜合考慮，本試驗(yàn)選擇流速為2BV/h。

圖4　流速對(duì)吸附量的影響

2.2.3粗提液pH對(duì)樹(shù)脂吸附能力的影響

將粗提液用10％HCl和10％NaOH調(diào)節(jié)成不同pH值的溶液，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。由于多酚呈弱酸性，所以要達(dá)到較好的效果必須在弱酸性條件下進(jìn)行吸附。當(dāng)粗提液pH=4.80時(shí)，AB-8樹(shù)脂對(duì)蘋(píng)果多酚的吸附能力最強(qiáng)。在較高的pH（pH>4.80）條件下，酚羥基由于解吸而增加了其在水中的溶解度，從而降低了樹(shù)脂在水溶液中對(duì)多酚的吸附能力。而當(dāng)pH<4.80時(shí)，部分黃酮類物質(zhì)改變性質(zhì)，樹(shù)脂吸附能力下降。因此，pH為4.80時(shí)，樹(shù)脂吸附能力較強(qiáng)。

圖5　pH對(duì)解吸效果的影響

2.2.4不同解吸速度對(duì)洗脫效果的影響

圖6　蘋(píng)果多酚解析曲線

選擇濃度為1.1mg/mL的粗提液，采用2BV/h的流速進(jìn)行吸附，以5BV去離子水洗滌，然后用70％乙醇進(jìn)行洗脫，解析流速采用1BV/h、2BV/h，分時(shí)段測(cè)定洗脫液中多酚的含量，制定解吸效果的曲線，結(jié)果見(jiàn)圖6。

解吸流速大小影響解吸效果，流速過(guò)快，解吸拖尾嚴(yán)重，洗脫帶寬，洗脫不徹底，效果差；流速過(guò)慢，解吸時(shí)間長(zhǎng)，蘋(píng)果多酚易損失。常用的解吸流速是吸附流速的1/3～1/2，由圖6可以看出，不同流速對(duì)解吸能力是有一定的影響，以1BV/h的流速進(jìn)行洗脫得到的峰形集中，2BV/h的流速洗脫則略有拖尾現(xiàn)象，故采用1BV/h的解吸流速，即為吸附流速的1/2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明解吸效果較為理想。經(jīng)過(guò)計(jì)算所得的蘋(píng)果多酚制品的純度由純化前的6.8％提高到15.5％。

2.3蘋(píng)果多酚的精制

經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂純化后的樣品仍含有較多糖類。采用SephadexG25可以對(duì)蘋(píng)果多酚進(jìn)行進(jìn)一步精制。SephadexG25屬于分子篩凝膠，具有分子篩特性，可按分子量大小分離物質(zhì)，適合于不同類型有機(jī)物的分離，并且性質(zhì)穩(wěn)定，易實(shí)施循環(huán)操作。

樣液上柱后用蒸餾水洗脫，流速1mL/min，每8min收集一次洗脫液，1～10為水洗液，10管后采用80％的乙醇以0.5mL/min的流速進(jìn)行洗脫，每管按照0.5mL/min的量收集洗脫液，然后逐管分別進(jìn)行多酚的測(cè)定，結(jié)果如圖7所示。從圖7可以看到，比較明顯的峰有6個(gè)，其中最早出現(xiàn)的峰多酚含量較少，自25管之后多酚的含量明顯增加，25～50管之間為多酚分布的高峰區(qū)間，合并25管之后的洗脫液進(jìn)行組成測(cè)定。

圖7　SesphedexG25精制蘋(píng)果多酚的結(jié)果

2.4蘋(píng)果多酚的組成研究

將10種標(biāo)準(zhǔn)品，綠原酸、兒茶素、表兒茶素、沒(méi)食子酸、根皮苷、槲皮素、阿魏酸、對(duì)香豆酸、咖啡酸各取少量，用甲醇溶解后，混合稀釋至合適的濃度，按1.7中所述的色譜條件，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，做圖，標(biāo)準(zhǔn)品圖譜結(jié)果見(jiàn)圖8。

在蘋(píng)果渣中共檢測(cè)出5種多酚物質(zhì)，分別是綠原酸、表兒茶素、兒茶素、對(duì)香豆酸和根皮苷，見(jiàn)圖9（1、表兒茶素，2、綠原酸，3、兒茶素，4、對(duì)香豆酸，5、根皮苷）。從蘋(píng)果多酚物質(zhì)組成及比例上看，綠原酸含量最高，約占多酚物質(zhì)的85％，其它如兒茶素、對(duì)香豆酸、根皮苷等含量較低。精制后的蘋(píng)果多酚，經(jīng)冷凍干燥，得到產(chǎn)品蘋(píng)果多酚粉末。經(jīng)過(guò)計(jì)算所得蘋(píng)果多酚得率為0.12％，蘋(píng)果多酚的含量由初步純化的15.5％提高到75.6％。

圖8　標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

圖9　蘋(píng)果多酚圖譜

3　結(jié)論

本研究選用AB-8大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行蘋(píng)果多酚的柱層析純化，采用2BV/h吸附流速，1BV/h的解吸流速，可將蘋(píng)果多酚較好的洗脫下來(lái)。大孔樹(shù)脂純化后的蘋(píng)果多酚經(jīng)Sephadex精制得到純度較高的多酚產(chǎn)品。此時(shí)，蘋(píng)果多酚總酚得率為0.12％，含量為75.60％。

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The Research of Column Chromatography Separation of Apple Polyphenols in Apple Rvesidue

GE Bang-guo SONGYe
(Jinan Fruit Research Institute All China Federation ofSupply&MarketingCo-operatives,Jinan 250014,China)

Abstract:Research the purification of apple polyphenols from apple residue by macroporous adsorption resin,sephadex purification process parameters of apple polyphenols,select AB-8 for purification with macroporous adsorption resin,use 70％ethanol as a desorption agent.Apple polyphenols after purification by Sephadex,after freeze drying,get apple polyphenol powder,yield is 0.12％,content increased from 15.5％to 75.6％。

Key words:Apple polyphenols;macroporous resin;purification;refined

作者簡(jiǎn)介：葛邦國(guó)（1978—），男，碩士，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)楣呔罴庸?/p>

基金項(xiàng)目：國(guó)家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2010GB24420688）

收稿日期：2015-09-01

中圖分類號(hào)：TS255.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-1038(2016)02-0020-05