飼料中添加枯草芽孢桿菌對方斑東風(fēng)螺稚螺生長、肌肉組成與免疫功能的影響

■冼健安陳　江張秀霞方　哲黃丹楓王冬梅

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南?？?71101；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北武漢430070）

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飼料中添加枯草芽孢桿菌對方斑東風(fēng)螺稚螺生長、肌肉組成與免疫功能的影響

■冼健安1陳江2張秀霞1方哲1黃丹楓2王冬梅1

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南?？?71101；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北武漢430070）

摘要：為探討飼料中添加枯草芽孢桿菌對方斑東風(fēng)螺稚螺生長、肌肉組成與免疫功能的影響，在基礎(chǔ)飼料中添加3個不同濃度（2.34×105、2.34×107CFU/100 g和2.34×109CFU/100 g）的枯草芽孢桿菌，養(yǎng)殖初始體重為0.62 g的方斑東風(fēng)螺10周。結(jié)果顯示，與對照組相比，添加枯草芽孢桿菌濃度為2.34×109CFU/100 g時，增重率和特定生長率有顯著的提高（P<0.05），增重率相對對照組提高了11.4%；與對照組相比，試驗(yàn)組的臟體比、肥滿度、存活率、肌肉體組成沒有顯著性差異（P>0.05）；添加枯草芽孢桿菌對過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽還原酶（GR）活力沒有顯著影響（P>0.05）；添加濃度為2.34×105CFU/100 g時，東風(fēng)螺肝胰腺的超氧化物歧化酶（SOD）活力提高17.8%（P<0.05）；添加濃度為2.34×109CFU/100 g時，堿性磷酸酶（AKP）活力提高61.9%（P<0.05），而添加濃度為2.34×107和2.34× 109CFU/100 g時，酸性磷酸酶（ACP）活力分別提高28.9%和94.6%（P<0.05）。這些結(jié)果表明，飼料中添加2.34×109CFU/100 g的枯草芽孢桿菌可顯著提高方斑東風(fēng)螺稚螺的生長性能和部分非特異性免疫功能。

關(guān)鍵詞：方斑東風(fēng)螺；枯草芽孢桿菌；配合飼料；免疫

Effects of dietary Bacillussubtilison growth performance, muscle composition and immunity of Babyloniaareolata

Xian Jian’an, Chen Jiang, Zhang Xiuxia, Fang Zhe, Huang Danfeng, Wang Dongmei

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Key words：Babyloniaareolata；Bacillussubtilis；compound feed；immunity

方斑東風(fēng)螺（Babyloniaareolata）味道鮮美、營養(yǎng)價值高，隨著人工育苗和養(yǎng)殖技術(shù)的成功，我國東南沿海以及越南、泰國等東南亞國家興起了養(yǎng)殖東風(fēng)螺的熱潮，東風(fēng)螺養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展前景良好[1]。但目前東風(fēng)螺的養(yǎng)殖仍主要以冰鮮魚為餌料，存在餌料供應(yīng)不穩(wěn)定、殘餌不易清理、養(yǎng)殖水體污染嚴(yán)重、病原大量滋生等問題，直接制約了東風(fēng)螺養(yǎng)殖的規(guī)?；?、可持續(xù)化發(fā)展。研制污染小、營養(yǎng)全面以及可增強(qiáng)免疫力的專用配合飼料代替冰鮮魚，是東風(fēng)螺養(yǎng)殖業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展的重要保障。近年來，東風(fēng)螺營養(yǎng)需求的研究已相繼開展[2-7]，但其配合飼料仍有待進(jìn)一步的優(yōu)化。

益生菌已作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物配合飼料中，研究表明，飼料中添加一定含量的益生菌可提高水產(chǎn)動物的飼料轉(zhuǎn)化率、促進(jìn)生長、增強(qiáng)免疫力[8-9]。在過往的研究中，本研究組針對兩種芽孢桿菌對方斑東風(fēng)螺免疫力的影響進(jìn)行了初探，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌能顯著提高方斑東風(fēng)螺的免疫功能，而地衣芽孢桿菌則表現(xiàn)出免疫抑制作用[10]。為進(jìn)一步探明枯草芽孢桿菌的作用，本試驗(yàn)研究了不同添加量枯草芽孢桿菌對方斑東風(fēng)螺的生長性能、肌肉組分以及免疫功能的影響，為枯草芽孢桿菌在東風(fēng)螺飼料中的合理應(yīng)用提供參考。

1材料和方法

1.1飼料配制

本飼料是以魚粉為主要的蛋白源，α-淀粉為主要糖源，魚油為主要脂肪源配制試驗(yàn)所需要的基礎(chǔ)飼料，基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1?？莶菅挎邨U菌菌粉（細(xì)菌含量為1.17×1010CFU/g）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院熱帶生物技術(shù)研究所提供。不添加枯草芽孢桿菌的基礎(chǔ)飼料組為對照組，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼料中分別添加三個不同濃度的枯草芽孢桿菌：2.34×105、2.34×107CFU/100 g和2.34×109CFU/100 g。各原料粉碎后過80目篩，然后按照配方稱取原料，用飼料混合機(jī)混合均勻，再加入魚油以及含有不同濃度枯草芽孢桿菌的水，混合揉成面團(tuán)狀軟顆粒飼料，按照估算的日投喂量小份分裝，置于-20℃冰箱保存，投喂前解凍至室溫。

表1基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(%)

1.2養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)于2014年6月~8月在海南省瓊海市長坡鎮(zhèn)椰林村某方斑東風(fēng)螺養(yǎng)殖場內(nèi)進(jìn)行。方斑東風(fēng)螺稚螺由該養(yǎng)殖場提供，選取同一批螺苗，暫養(yǎng)在30 cm×40 cm×35 cm規(guī)格的塑料箱中，用基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)兩周。挑選活力好、規(guī)格相近的個體作為試驗(yàn)稚螺，隨機(jī)分配至各組中，每組3個重復(fù)。箱子底部鋪上3~4 cm厚的沙子，海水進(jìn)行過濾后用作試驗(yàn)用水，鹽度30‰~31‰，水溫(27±2)℃，流水養(yǎng)殖。飼料日投喂量為螺重的4%~5%，并根據(jù)實(shí)際攝食情況進(jìn)行調(diào)整，每天19:00投喂。養(yǎng)殖周期為10周。

1.3樣品采集與指標(biāo)測定

東風(fēng)螺取樣前禁食24 h，統(tǒng)計(jì)存活率（SR）后，稱量終末體重（FBW），計(jì)算試驗(yàn)方斑東風(fēng)螺的增重率（WGR）、特定生長率（SGR）和飼料系數(shù)（FC）。東風(fēng)螺放入液氮中速凍，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室置于-80℃冰箱保存。

1.3.1生長性能

增重率（weight gain rate，WGR，%）=100×（螺終末平均體重-螺初始平均體重）/螺初始平均體重；

特定生長率（specific growth rate，SGR，%/d）= 100×（Ln螺終末平均體重-Ln螺初始平均體重）/飼養(yǎng)天數(shù)；

肉殼比=螺肉的質(zhì)量(g)/螺殼的質(zhì)量(g)；

存活率（survival rate，SR，%）=100×試驗(yàn)結(jié)束時螺的顆數(shù)/開始時螺的顆數(shù)；

臟體比（viscerosomic index，VSI，%）=100×內(nèi)臟團(tuán)重(g)/螺體重(g)；

肥滿度（condition factor，CF）=肉重(g)/螺體重(g)。

1.3.2飼料和肌肉營養(yǎng)組成

用105℃烘箱干燥法測定飼料和螺肌肉的水分（GB/T 6435—1986）；將烘干的飼料和螺肌肉組織粉碎，用凱氏定氮法測定飼料和螺肌肉的粗蛋白含量（GB/T 6432—1994）；用索氏抽提法測定飼料和螺肌肉的粗脂肪含量（GB/T 6433—1994）；采用550℃灼燒法測定灰分含量（GB/T 6438—1992）。

1.3.3免疫酶活性

每個重復(fù)各隨機(jī)選取3只螺，每飼料組共9只，每只螺的組織單獨(dú)測定。在-80℃冰箱取出樣品，待適當(dāng)解凍后，于冰上解剖分離出肝胰臟，用4℃的生理鹽水沖洗，用吸水紙將水吸干，準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量體積比加入9倍的生理鹽水制成10%的組織勻漿，4℃、2 500 r/min離心10 min，取上清液用于酶活測定。組織勻漿粗提液蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)法測定。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）、堿性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活性測定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示，利用SPSS19.0對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），P<0.05確認(rèn)為差異顯著。

2　結(jié)果

2.1枯草芽孢桿菌對方斑東風(fēng)螺生長性能和肌肉組成的影響（見表2~表3）

表2飼料中添加枯草芽孢桿菌對方斑東風(fēng)螺生長性能的影響

表3飼料中添加枯草芽孢桿菌對方斑東風(fēng)螺肌肉組成的影響（%）

飼料中添加2.34×109CFU/100 g的枯草芽孢桿菌顯著提高了螺的增重率和特定生長率（P<0.05），增重率相對對照組提高了11.4%。與對照組相比，飼料中添加枯草芽孢桿菌對螺的肥滿度、肉殼比、臟體比和存活率均沒有顯著影響（P>0.05）。如表3所示，飼料中添加枯草芽孢桿菌對方斑東風(fēng)螺肌肉的水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分含量沒有顯著影響（P> 0.05）。

2.2枯草芽孢桿菌對方斑東風(fēng)螺免疫功能的影響（見表4）

結(jié)果如表4所示，與對照組相比，飼料中添加濃度為2.34×105CFU/100 g的枯草芽孢桿菌使東風(fēng)螺肝胰腺SOD活力提高17.8%（P<0.05）；飼料中添加枯草芽孢桿菌對CAT和GR活力沒有顯著影響（P>0.05）；飼料中添加2.34×109CFU/100 g的枯草芽孢桿菌使東風(fēng)螺的AKP活力提高61.9%（P<0.05）；添加濃度為2.34×107CFU/100 g和2.34×109CFU/100 g時，ACP活力分別提高28.9%和94.6%（P<0.05）。

3　討論

3.1枯草芽孢桿菌對方斑東風(fēng)螺生長性能的影響

表4飼料中添加枯草芽孢桿菌對方斑東風(fēng)螺免疫功能的影響

芽孢桿菌廣泛存在于自然界中，是目前使用最為廣泛的益生菌種類之一，具有安全、穩(wěn)定、不產(chǎn)生抗藥性、無毒害殘留等優(yōu)點(diǎn)，是抗生素的絕佳替代品[9]。其中，枯草芽孢桿菌是我國農(nóng)業(yè)部允許直接投喂動物的微生物添加劑，在目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中最為常用的芽孢桿菌。以往的研究已表明，飼料中添加各類芽孢桿菌能夠提高斑點(diǎn)叉尾鮰（IetalurusPunetaus）、黑鯛（Acan?thopagrus schlegelii）、雜交鱘（Acipenser baeri♂× Acipenserschrenkii♀）、奧尼羅非魚（Oreochromisni?loticus×O. aureus）、草魚（Ctenopharyngodon idellus）、青魚（Mylopharyngodonpiceus）、異育銀鯽（allogynoge?neticcruciancarp）以及凡納濱對蝦（Litopenaeusvan?namei）等的生長性能[11-20]。一般認(rèn)為，芽孢桿菌能夠定植在動物腸道內(nèi)，產(chǎn)生維生素、氨基酸、促生長因子等多種營養(yǎng)物質(zhì)，并且產(chǎn)生多種酶類，提高動物體的消化酶活力，參與胃腸道的代謝過程，提高飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率，從而促進(jìn)動物的生長[8]。也有報道顯示，枯草芽孢桿菌可以通過改善草魚腸道黏膜形態(tài)，促進(jìn)其對飼料的吸收利用，從而促進(jìn)其生長[12]。在本研究中，添加枯草芽孢桿菌濃度為2.34×109CFU/100 g時，增重率和特定生長率也有顯著提高，與上述研究結(jié)果一致，表明枯草芽孢桿菌可以作為飼料添加劑應(yīng)用于方斑東風(fēng)螺稚螺的配合飼料中，可有效促進(jìn)方斑東風(fēng)螺的生長性能。但也有研究顯示，飼料中添加0.03%~0.18%的枯草芽孢桿菌對吉富羅非魚（Oreo?chromis niloticus）的生長性能沒有顯著影響[21]，添加0.2%的芽孢桿菌使網(wǎng)箱養(yǎng)殖鯉（Cryprinuscarpiod）的增重率和飼料利用率下降[22]。造成這些研究結(jié)果的差異，可能與養(yǎng)殖動物品種差異、芽孢桿菌菌種差異、芽孢桿菌對試驗(yàn)動物腸道以及水體環(huán)境的適應(yīng)性等有關(guān)。

飼料中添加枯草芽孢桿菌對水產(chǎn)動物形體指標(biāo)影響的結(jié)果也存在一定的差異。隨著枯草芽孢桿菌添加量的提高，斑點(diǎn)叉尾鮰的腸體比和肝體比都出現(xiàn)先增加后降低的趨勢，添加組的肥滿度都低于對照組，但差異不顯著[11]。飼料中添加枯草芽孢桿菌對草魚的肥滿度、體質(zhì)量體長比、臟體比均沒有顯著影響，僅2 000 mg/kg組魚的肝體比顯著大于對照組[23]。飼料添加枯草芽孢桿菌對黑鯛的肝體指數(shù)沒有顯著影響[13]。本研究結(jié)果顯示，飼料中添加枯草芽孢桿菌后，方斑東風(fēng)螺的肥滿度、肉殼比、臟體比均沒有顯著變化，表明在基礎(chǔ)飼料的營養(yǎng)成分已能滿足東風(fēng)螺正常生長需要的情況下，其可食用部分，即肌肉部分的比例較為恒定，不受枯草芽孢桿菌添加的影響?？莶菅挎邨U菌對形體指標(biāo)的影響可能與試驗(yàn)動物以及菌種的差異有較大關(guān)系。

3.2枯草芽孢桿菌對方斑東風(fēng)螺肌肉組成的影響

斑點(diǎn)叉尾鮰的研究結(jié)果顯示，在飼料中添加300、500 mg/kg和700 mg/kg的枯草芽孢桿菌可使魚肌肉中粗蛋白質(zhì)與對照組相比分別提高了6.62%、11.00% 和10.36%[11]。但另外一些研究顯示，飼料中添加枯草芽孢桿菌對體組成沒有顯著影響。攝食添加枯草芽孢桿菌的飼料的青魚魚種與對照組青魚魚種相比，其全魚營養(yǎng)組成均無顯著差異[17]。飼料中添加枯草芽孢桿菌對黑鯛幼魚全魚和肌肉組成均沒有顯著影響[13]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，飼料中添加枯草芽孢桿菌對方斑東風(fēng)螺稚螺肌肉組成沒有顯著影響。

3.3枯草芽孢桿菌對方斑東風(fēng)螺免疫功能的影響

眾多研究已顯示，枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑可在一定程度上提高水產(chǎn)動物的免疫功能和抗氧化活力。投喂添加枯草芽孢桿菌飼料的黑鯛幼魚血清總蛋白水平，及CAT、SOD活性顯著提高，肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性也顯著提高[13]?？耸显r（Procambarusclarkii）血細(xì)胞吞噬活性于投喂枯草芽孢桿菌后第7 d開始顯著高于對照組，溶菌活力、抗菌活力也顯著提高[24]。在飼料中添加0.25%枯草芽孢桿菌可顯著提高雜交鱘的血清溶菌酶、AKP、SOD活力及總抗氧化能力(T-AOC)[14]。然而，一些研究也發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌對不同的免疫指標(biāo)也有不同的作用效果。飼料中添加枯草芽孢桿菌可顯著提高凡納濱對蝦血清ACP和酚氧化物酶（PO）活力，而對血清SOD和過氧化物酶（POD）活力沒有顯著影響[18]。投喂添加枯草芽孢桿菌飼料的草魚血清中免疫球蛋白M、補(bǔ)體C3含量和AKP活性，血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白含量，白球比以及溶菌酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性無顯著變化，血清和肝胰臟中T-AOC、CAT、SOD活力以及肝胰臟中還原型谷胱甘肽（GSH）含量顯著升高[25]。在本研究組前期的研究中也發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.5%的枯草芽孢桿菌對東風(fēng)螺肝胰腺SOD和CAT活力沒有顯著影響，而顯著提高POD活力[10]。在本研究中，低濃度（2.34×105CFU/100 g）的枯草芽孢桿菌可顯著提高東風(fēng)螺肝胰腺SOD活力，3個濃度的枯草芽孢桿菌均對CAT和GR活力沒有顯著影響，最高濃度（2.34×109CFU/100 g）則顯著提高AKP和ACP活力。綜合生長性能指標(biāo)來看，在方斑東風(fēng)螺飼料中添加本研究所用的枯草芽孢桿菌菌粉，其濃度以2.34× 109CFU/100 g為宜。

枯草芽孢桿菌對水產(chǎn)動物免疫功能和抗氧化活力的影響也可能受到養(yǎng)殖動物、菌種以及環(huán)境條件的差異等各類因素的影響?？傮w而言，枯草芽孢桿菌對水產(chǎn)動物生長和免疫的作用機(jī)理是多方面的，各方面相互影響，且由于養(yǎng)殖對象自身特性的差異，應(yīng)用效果和適宜添加量也就有所差別。通過試驗(yàn)篩選適合某種水產(chǎn)動物使用的高效菌種，并確定其適宜的添加范圍是目前最直接有效的途徑。

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（編輯：劉占，laramie_liu@139.com）

基金項(xiàng)目：海南省重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目[ZDXM20130047]；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金[ITBB2015ZY01；ITBB2015ZD03]

收稿日期：2015-11-10

通訊作者：王冬梅，研究員。

作者簡介：冼健安，博士，助理研究員，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料學(xué)、水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)及毒理學(xué)。

中圖分類號：S816.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-991X（2016）04-0005-05

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.04.002