葫蘆科蔬菜單倍體育種技術(shù)研究進(jìn)展
——未授粉子房離體培養(yǎng)技術(shù)

黃金華，董彥琪，王文英，劉喜存，馬曉紅

（河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453000）

未授粉子房/胚珠離體培養(yǎng)技術(shù)屬于離體雌核發(fā)育途徑（in vitro gynogenesis）[1-5]，是將未授粉子房/胚珠從母體上分離出來(lái)，在無(wú)菌的人工環(huán)境條件下誘導(dǎo)雌核發(fā)育，使其生長(zhǎng)發(fā)育形成單倍體胚和植株的過(guò)程。利用該技術(shù)可快速獲得純系，縮短育種周期，加速育種進(jìn)程。筆者側(cè)重綜述了該技術(shù)的一些重要影響因素，如基因型、胚囊發(fā)育時(shí)期、接種方式、植株生長(zhǎng)環(huán)境、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、碳源、硝酸銀、低溫預(yù)處理、熱激處理、倍性鑒定以及植株再生等，為該技術(shù)的開(kāi)展和應(yīng)用提供可行的理論依據(jù)。

1 基因型

基因型是影響未授粉子房胚胎發(fā)生的重要因素之一，選擇合適的基因型是植物未授粉子房離體培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。Shalaby[2]對(duì)12種不同基因型西葫蘆品種的未授粉子房培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，‘Raad’F1材料表現(xiàn)最佳，胚誘導(dǎo)率為48.4%，每皿成苗15株。謝冰等[6-7]和劉栓桃等[8]研究也表明西葫蘆雌核離體培養(yǎng)存在明顯的基因型差異。劉栓桃等[8]對(duì)9個(gè)不同基因型西葫蘆材料的未授粉胚珠誘導(dǎo)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，再生植株率最高的能達(dá)到33.33%，最低的僅為2.67%。杜勝利等[9]研究發(fā)現(xiàn)‘津春3號(hào)’的胚芽和愈傷組織誘導(dǎo)率均高于‘津雜2號(hào)’；陳小鵬等[10]也認(rèn)為黃瓜基因型對(duì)雌核發(fā)育有著重要的影響。裴曉利等[11]研究表明，不同基因型黃瓜的未授粉子房對(duì)離體誘導(dǎo)培養(yǎng)的敏感度不同，9個(gè)品種單倍體誘導(dǎo)率變化幅度為65.52%～93.33%。Ficcadenti等[5]對(duì)2個(gè)甜瓜品種（‘Reticulatus’‘Inodorus’）及其雜交種進(jìn)行了未授粉子房培養(yǎng)，結(jié)果顯示，‘Reticulatus’出胚率最高。韓麗華等[12]研究發(fā)現(xiàn)甜瓜不同的正反交組合對(duì)單倍體的誘導(dǎo)有顯著影響。

2 胚囊發(fā)育時(shí)期

胚囊發(fā)育時(shí)期對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)至關(guān)重要。謝冰等[6-7]研究表明開(kāi)花前1 d和開(kāi)花當(dāng)日西葫蘆胚珠誘導(dǎo)頻最高；劉栓桃等[8]對(duì)9個(gè)西葫蘆材料進(jìn)行不同開(kāi)花時(shí)期取材試驗(yàn)，結(jié)果表明除1個(gè)材料沒(méi)能得到再生植株外，其他均表現(xiàn)為開(kāi)花當(dāng)天的胚珠最適合誘導(dǎo)培養(yǎng)，再生植株率最高；陳學(xué)軍等[13]研究表明處于成熟胚囊期即開(kāi)花當(dāng)天的西葫蘆未授粉子房的胚狀體誘導(dǎo)率、成苗率均最高。Gémesné等[14]發(fā)現(xiàn)黃瓜雌花開(kāi)放前6 h胚囊剛好形成，胚誘導(dǎo)率最高。刁衛(wèi)平等[15]發(fā)現(xiàn)，開(kāi)花前1～4 d的黃瓜子房均可誘導(dǎo)獲得胚芽，但以開(kāi)花前2～3 d的子房誘導(dǎo)率最高。Shalaby[2]對(duì)南瓜‘Giad’‘Raad’F1代的第一節(jié)雌花、第二節(jié)雌花和第三節(jié)雌花分別進(jìn)行未授粉胚珠離體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)第二節(jié)雌花胚誘導(dǎo)和成苗效果最佳。孫守如等[16]發(fā)現(xiàn)開(kāi)花前1 d的南瓜胚珠已成熟或接近成熟，易于誘導(dǎo)。

3 接種方式

接種方式直接影響雌核發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)吸收，從而影響雌核發(fā)育的途徑。陳學(xué)軍等[13]比較4種接種方法對(duì)愈傷組織的影響，結(jié)果表明橫切分法接種的胚珠最先從切口處長(zhǎng)出愈傷組織，且愈傷組織誘導(dǎo)率最高可達(dá)28%；其次為啄切、縱切而以完整胚珠法所得愈傷組織誘導(dǎo)率最低，為6%。究其原因可能是橫切、啄切和縱切給外植體以較大的創(chuàng)傷面而激發(fā)了愈傷組織的形成，也可能是創(chuàng)傷面增強(qiáng)了未授粉胚珠對(duì)養(yǎng)分的吸收能力。

4 生長(zhǎng)環(huán)境

季節(jié)對(duì)未授粉子房離體培養(yǎng)的影響是顯著的，這可能與植物的生理生長(zhǎng)特性有關(guān)。Przyborowski等[17]在黃瓜單倍體誘導(dǎo)中發(fā)現(xiàn)，春季材料的誘導(dǎo)率很低，僅是夏季材料誘導(dǎo)率的1/4。魏愛(ài)民等[18]研究表明黃瓜離體雌核發(fā)育的單倍體胚胎發(fā)生率和植株再生率在溫度相對(duì)較高的6月下旬、7月上旬以及9月份明顯高于其他季節(jié)；生長(zhǎng)發(fā)育前期的供體植株單倍體再生率相對(duì)較高且穩(wěn)定；隨著供體植株逐漸衰老，其未授粉子房培養(yǎng)的污染率不斷上升；種植于塑料大棚內(nèi)的供體材料比種植在露地中的供體材料具有更高的單倍體胚胎發(fā)生率和成苗率。盛慧[19]試驗(yàn)結(jié)果表明，秋季生長(zhǎng)的黃瓜材料誘導(dǎo)率要高于春季，且不易污染，冬季的誘導(dǎo)效果一般。

此外，謝冰等[7]證實(shí)不同播期的西葫蘆材料胚狀體發(fā)生率存在極顯著差異，秋播材料的誘導(dǎo)率最高，夏播與春播都很低；孫守如等[16]在南瓜上也發(fā)現(xiàn)胚狀體發(fā)生和小苗的誘導(dǎo)集中在7月中旬和8月中旬。

5 培養(yǎng)基

5.1 基本培養(yǎng)基

黃瓜未授粉子房的離體培養(yǎng)一般采用MS培養(yǎng)基或是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上對(duì)某些成分作一些調(diào)整[14]，也有使用專門針對(duì)黃瓜離體雌核誘導(dǎo)的CBM作為基本培養(yǎng)基的[9]。謝冰[6-7]和陳學(xué)軍等[13]在西葫蘆未授粉胚珠離體培養(yǎng)中分別采用的是N6培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基。謝冰等[7]研究認(rèn)為培養(yǎng)基對(duì)西葫蘆胚狀體誘導(dǎo)率影響較大，篩選的M3、M2培養(yǎng)基有較高的利用價(jià)值。厚皮甜瓜的離體雌核誘導(dǎo)也是在MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚狀體發(fā)育成苗的[12]。

5.2 激素

激素對(duì)胚發(fā)生有著重要作用。Metwally等[4]在誘導(dǎo)西葫蘆未授粉胚胎分化時(shí)分別使用質(zhì)量濃度為 0.1、1.0、5.0、10.0 mg·L-1的 2，4-D，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 1.0和5.0mg·L-12，4-D處理的胚誘導(dǎo)率較高。謝冰等[7]篩選出2組適合西葫蘆胚狀體誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，分別是N6+2.00 mg·L-12，4-D+0.5 mg·L-1NAA+1.00 mg·L-1BA 和 N6+4.00 mg·L-12，4-D+0.25 mg·L-1NAA+1.00 mg·L-16-BA。陳學(xué)軍等[13]在西葫蘆未授粉胚珠培養(yǎng)過(guò)程中用 MS+1.00 mg·L-12，4-D+0.50 mg·L-1NAA+1.00 mg·L-1BA誘導(dǎo)出愈傷組織。

陳小鵬等[10]在黃瓜未授粉子房的胚狀體誘導(dǎo)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TDZ明顯促進(jìn)胚狀體的生長(zhǎng)和膨大，質(zhì)量濃度為0.06和0.08 mg·L-1時(shí)胚狀體誘導(dǎo)率（分別為66.7%和64.9%）都極顯著高于其他處理，并且兩者之間沒(méi)有顯著差異。Diao等[20]認(rèn)為，TDZ能促進(jìn)黃瓜胚胎形成，以0.04 mg·L-1效果最佳。Malik等[21]研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.04和0.02 mg·L-1的TDZ能有效促進(jìn)甜瓜未授粉子房胚珠愈傷產(chǎn)生，胚誘導(dǎo)率分別為46.60%和65.83%，而質(zhì)量濃度為0.60 mg·L-1的6-BA激素可顯著提高外植體再生率。

此外，Kwack等[22]研究認(rèn)為，植物激素對(duì)南瓜的胚發(fā)生有著重要作用。韓麗華等[12]用細(xì)胞分裂素Zip、BA和IBA成功地誘導(dǎo)出厚皮甜瓜的胚狀體植株。

5.3 碳源

一般采用蔗糖作為碳源。謝冰等[6]關(guān)于西葫蘆離體雌核培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體的試驗(yàn)表明，30 g·L-1蔗糖對(duì)胚狀體的發(fā)生是有利的，誘導(dǎo)率較高。陳小鵬等[10]試驗(yàn)表明蔗糖質(zhì)量濃度為40 g·L-1時(shí)黃瓜胚狀體誘導(dǎo)效果最好。Shalaby[2]在西葫蘆品種‘Eskan?drani’胚珠誘導(dǎo)時(shí)使用 30、60、90 g·L-1的蔗糖質(zhì)量濃度梯度比較發(fā)現(xiàn)，30 g·L-1時(shí)胚珠誘導(dǎo)效率最佳，而90 g·L-1時(shí)胚珠完全不能生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明，在愈傷組織芽分化時(shí)可能需要較低的滲透壓。韓麗華等[12]研究表明甜瓜胚狀體誘導(dǎo)適宜蔗糖質(zhì)量濃度為 30 g·L-1。

5.4 AgNO3

AgNO3是乙烯合成的抑制劑。Mohiuddin等[23]認(rèn)為AgNO3影響愈傷組織的內(nèi)源激素代謝從而有利于瓜類作物植株的再生。韓麗華等[12]研究表明AgNO3有利于甜瓜胚狀體的誘導(dǎo)，當(dāng)質(zhì)量濃度為 80 mg·L-1時(shí)出胚率最高，為0.74%。這可能是由于NO3-影響了離體培養(yǎng)過(guò)程中的某種激素的代謝，從而間接影響了胚狀體的形成與生長(zhǎng)。而Diao等[20]研究發(fā)現(xiàn)AgNO3對(duì)胚誘導(dǎo)并沒(méi)有顯著影響，但會(huì)縮短胚胎萌芽期和提高胚胎形成數(shù)目，且選用的材料之間出胚率并無(wú)顯著差異。

6 處理方式

6.1 低溫預(yù)處理

低溫預(yù)處理極有可能改變雌核發(fā)育途徑，從而導(dǎo)致單倍體胚形成。Kwack等[22]研究表明，南瓜在5℃條件下預(yù)處理2d能提高胚胎的發(fā)生率。Shalaby[2]研究表明西葫蘆品種‘Queen’F1在4℃預(yù)處理4 d時(shí)效果最佳。Metwally等[4]將開(kāi)花前1 d的西葫蘆品種‘Eskandarani’在4℃條件下分別進(jìn)行0、2、4、8d 預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不進(jìn)行預(yù)處理的的材料具有最高的胚誘導(dǎo)率。

6.2 熱激處理

Gémesné等[14]對(duì)黃瓜離體雌核進(jìn)行熱激處理，結(jié)果表明，在誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)35℃熱激處理2～4 d獲得的胚狀體誘導(dǎo)率和植株再生誘導(dǎo)率最高。Diao等[20]進(jìn)一步對(duì)黃瓜熱激處理，在35℃條件下熱激3 d的效果較2 d和4 d的好。陳小鵬等[10]認(rèn)為35℃熱激處理是黃瓜未授粉子房胚狀體誘導(dǎo)的最佳預(yù)處理溫度。Shalaby[2]研究表明西葫蘆品種‘Queen’F1在32℃熱激處理4 d時(shí)效果最佳。

7 倍性鑒定與植株再生

7.1 倍性鑒定

瓜類二倍體植株與單倍體、三倍體、四倍體在形態(tài)上有比較明顯的差別[24]，主要表現(xiàn)在子葉、真葉、花的形狀和顏色，果實(shí)形狀以及種子的形態(tài)。這些形態(tài)差異是從外觀上用目測(cè)法鑒別瓜類多倍體較為可靠的指標(biāo)。謝冰等[6]用西葫蘆未授粉胚珠誘導(dǎo)出120株再生植株，其中42株性狀表現(xiàn)符合二倍體植株（2n=2x=40）特征且育性正常，并獲得自交果實(shí)及種子。

對(duì)獲得的植株細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)是最有效的方法，但染色體制片需要較高的細(xì)胞學(xué)水平，且費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。Metwally等[4]對(duì)由西葫蘆未授粉子房離體誘導(dǎo)的20株再生植株的根尖染色體進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，有5株單倍體植株（2n=x=20）、15株二倍體植株（2n=2x=40）。Diao等[20]對(duì)40株再生黃瓜植株的卷須染色體染色進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，有2株單倍體植株（2n=x=7）、33株二倍體植株（2n=x=14）、5株四倍體植株（2n=4x=28）。

葉綠體數(shù)目隨染色體倍數(shù)的升高而增加，因而可采用氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法來(lái)間接鑒別再生植株的倍性。劉栓桃等[8]將西葫蘆未授粉胚珠誘導(dǎo)的20株再生植株經(jīng)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法鑒定，結(jié)果為8株單倍體植株，12株二倍體植株。

7.2 植株再生

謝冰等[6]在西葫蘆未授粉胚珠離體培養(yǎng)中，以20 g·L-1蔗糖或葡萄糖作碳源的無(wú)激素N6植株再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)出健全胚狀體的成苗。劉栓桃等[8]對(duì)4個(gè)西葫蘆品種未授粉子房培養(yǎng)，在質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-12，4-D 的培養(yǎng)基上再生植株產(chǎn)率最高，達(dá)28.33%。陳學(xué)軍等[13]在西葫蘆未授粉胚珠離體培養(yǎng)中，誘導(dǎo)的愈傷組織在MS+0.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1BA+2.0%蔗糖+0.8%瓊脂培養(yǎng)基上芽誘導(dǎo)率最高，為15.6%；高濃度的NO3-有利于不定芽根的形成，但其作用機(jī)制尚不清楚。孫守如等[16]研究發(fā)現(xiàn)觀賞南瓜未授粉胚珠誘導(dǎo)胚狀體的效果以 MS+1.0 mg·L-12，4-D+0.25 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-16-BA+30.0 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1瓊脂處理較好，分化、再生培養(yǎng)基分別以MS+30.0g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1瓊脂、MS+30 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1瓊脂+1.0 g·L-1活性炭效果最佳，其胚狀體發(fā)育成正常植株率達(dá)70%以上。

8 問(wèn)題與展望

利用未授粉子房培養(yǎng)技術(shù)獲得瓜類單倍體植株是一個(gè)較為成功的途徑，眾多國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究了一些影響因素，如基因型、胚囊發(fā)育時(shí)期、接種方式、植株生長(zhǎng)環(huán)境、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、碳源、硝酸銀、低溫預(yù)處理、熱激處理、倍性鑒定以及植株再生等，并取得了一些重要進(jìn)展，如2，4-D與NAA、6-BA配合使用雖然對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)率有利，但畸形胚狀體的比例較高，主要在誘導(dǎo)過(guò)程中出現(xiàn)畸形胚狀體或健全胚狀體轉(zhuǎn)接后表現(xiàn)出發(fā)育異常；誘導(dǎo)溫度高于35℃時(shí)接種組織的褐化和玻璃化情況較嚴(yán)重，生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入0.05 mg·L-1抗壞血酸針劑可有效防止胚狀體再生長(zhǎng)過(guò)程中的氧化；未授粉胚珠的取樣部位對(duì)胚狀體的形態(tài)建成及后續(xù)的成苗有顯著影響，子房中部的胚珠發(fā)育充分有利于誘導(dǎo)出健全胚狀體；葉片保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)鑒定法與再生植株自交后代田間性狀整齊度觀察相結(jié)合，不僅可鑒定再生植株的起源和倍性，而且還可對(duì)再生植株的農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查研究。

未授粉子房培養(yǎng)技術(shù)已在黃瓜、西葫蘆、甜瓜、南瓜等瓜類作物取得了單倍體胚和單倍體植株，該技術(shù)為研究離體雌核發(fā)育機(jī)制、開(kāi)展更廣泛的未授粉胚珠（雙）單倍體培養(yǎng)方法奠定了基礎(chǔ)。離體培養(yǎng)能夠引起各種類型的突變，影響培養(yǎng)物的遺傳穩(wěn)定性，這已是不爭(zhēng)的結(jié)論。瓜類離體雌核發(fā)育胚狀體的形成及成苗過(guò)程涉及的影響因素更為復(fù)雜，如需全面地了解再生植株成苗的機(jī)制，尚需進(jìn)行更加深入的研究。