葫蘆科蔬菜單倍體育種技術(shù)研究進(jìn)展
——花粉輻射和離體胚挽救技術(shù)

黃金華，董彥琪，劉喜存，王文英,王玲艷，朱紅彩

（河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453000）

輻射花粉授粉和離體胚挽救技術(shù)是用射線輻射瓜類即將開花或正開花的雄花花粉，然后給去雄的雌花授粉影響其受精進(jìn)而誘導(dǎo)其產(chǎn)生單倍體胚，再通過離體胚挽救獲得單倍體植株[1-6]。輻射花粉授粉和離體胚挽救技術(shù)是獲得葫蘆科作物單倍體（Haploid）和雙單倍體（Double haploid，DH）的主要途徑之一。利用該技術(shù)可快速獲得純系、縮短育種周期、加速育種進(jìn)程。本文側(cè)重綜述了該技術(shù)的一些重要影響因素，如基因型、輻射劑量、輻射劑量率、植株生長環(huán)境、花粉發(fā)育階段、離體胚挽救時(shí)間、胚發(fā)育時(shí)期、染色體加倍、倍性鑒定和植株再生技術(shù)等，為該技術(shù)的開展和應(yīng)用提供可行的理論依據(jù)。

1 基因型

基因型是影響輻射花粉授粉和離體胚挽救的關(guān)鍵因素之一。Lofti[7]和裴曉利等[8]研究表明，不同黃瓜基因型輻射花粉誘導(dǎo)單倍體產(chǎn)率有差異。雷春等[9]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)不同基因型花粉授粉要比同一基因型花粉授粉誘導(dǎo)的單倍體產(chǎn)率高。當(dāng)黃瓜母本為‘JL4’、父本為‘CC3（200）’和‘JL4（200）’時(shí)，坐果率分別50%和12.5%，并且只有以‘CC3（200）’為父本時(shí)才有單倍體產(chǎn)生，表現(xiàn)出一定的父本基因型差異；當(dāng)父本均為‘Y2A（300）’，母本分別為‘SL4’和‘Y2A’時(shí)，坐果率分別為37.5%和62.5%，單倍體產(chǎn)率（單倍體數(shù)/胚培養(yǎng)種子數(shù)）分別約為1.1%和0.4%，表現(xiàn)出一定的母本基因型差異。謝淼等[10]研究認(rèn)為，黃瓜基因型對植株再生率及單倍體再生率均有影響。而Caglar等[11]研究表明，黃瓜27種基因型對單倍體的誘導(dǎo)率沒有很大差別，每個(gè)果實(shí)中獲得的單倍體胚均約為3.8個(gè)，每個(gè)果實(shí)中獲得的單倍體植株數(shù)均約為1.1個(gè)；Faris等[12]試驗(yàn)了8種黃瓜基因型，進(jìn)一步證明同一劑量下的單倍體發(fā)生率同黃瓜基因型無關(guān)。

此外，Sestili等[13]研究表明不同的甜瓜正反交組合對單倍體誘導(dǎo)率的影響差異顯著。張永兵等[14]研究表明，甜瓜母本基因型對坐果和單倍體胚的形成都有一定的影響。

2 輻射劑量

常用的輻射源有放射性元素（35P，32S），離子束（X和γ射線）和非離子束（UV）。Faris等[12]認(rèn)為60Co-γ射線是誘導(dǎo)單倍體的有效輻射源。

確定適宜的輻射劑量是誘導(dǎo)雌核發(fā)育單倍體成敗的關(guān)鍵，實(shí)踐中大多以臨界劑量或半致死劑量作為適宜劑量的標(biāo)準(zhǔn)?；ǚ酃艿纳L與輻射劑量有顯著的相關(guān)性（R=0.97）[15]。輻射劑量同植物的倍性及花粉粒大小有關(guān)，倍性越高，花粉粒越小，越耐輻射[16]。西葫蘆上推薦劑量為25～50 Gy[4]；黃瓜和西瓜常用的推薦劑量為 200～300 Gy[3，17]；甜瓜上推薦劑量為 500～2 500 Gy[1，15]。

也有一些學(xué)者用X射線輻射花粉的報(bào)道，如Yashiro等[18]利用 X 射線（67.08 C·kg-1）輻射花粉，在5 個(gè)甜瓜基因型‘Earl＇s red’‘Carol’‘Quincy’‘Rupia red’和‘View red’上單倍體胚的誘導(dǎo)率分別為0.16%、0.03%、0.03%、0.13%和0.17%；查丁石[19]利用軟X射線以650 Gy的總輻射劑量照射獲得了甜瓜單倍體植株。

3 輻射劑量率

單倍體誘導(dǎo)頻率還受輻射劑量率的影響。Deunff等[20]研究發(fā)現(xiàn)高劑量會(huì)使黃瓜花粉管生長減慢，但是在授粉6 d之后，2種不同劑量率照射下的花粉管都已到達(dá)胚囊。許利彩等[21]研究表明，輻射劑量率對西葫蘆胚的誘導(dǎo)率、植株再生率及植株成活率均影響極顯著。輻射劑量率為45.19 Gy·min-1時(shí)獲得的不飽滿種子或不同形態(tài)胚的數(shù)量最多，為61個(gè)，植株再生率和植株成活率也最高，分別是91.80%和49.18%，與其他2個(gè)處理差異極顯著；25 Gy·min-1時(shí)獲得的不飽滿種子或不同胚狀體數(shù)量次多，為56個(gè)；而5 Gy·min-1最低，僅為26個(gè)，植株再生率和植株成活率也最低，分別是76.92%和26.92%。而 Cunny 等[15]研究表明，18 Gy·min-1和79 Gy·min-1（總劑量為500～3 600 Gy）對甜瓜花粉萌發(fā)率和活力沒有影響。

4 生長環(huán)境

環(huán)境因子對單倍體誘導(dǎo)率同樣有重要影響，適宜的溫度和濕度下單倍體發(fā)生率較高。6—9月甜瓜單倍體發(fā)生率[22]較高，秋季單倍體誘導(dǎo)率相對較低[15]。黃瓜也是在氣溫高的6—9月（地中海海洋性氣候）可得到較高單倍體發(fā)生率[17]。

5 花粉發(fā)育階段

花藥、花序、花芽及整朵花都可以進(jìn)行輻射處理，通常用開花前1 d的雄花進(jìn)行輻射處理，次日給母株授粉。Yanmaz等[23]研究表明，輻射劑量為350 Gy的黃瓜花粉活力最高，但花粉活力喪失最快，120 h之后花粉活力為0，最終得到0株單倍體。所以，盡量選用開花當(dāng)天的花粉立即輻射授粉，否則單倍體誘導(dǎo)率會(huì)大大降低；且每朵雌花需用3～4朵經(jīng)射線處理的雄花授粉，增加花粉管到達(dá)胚囊的數(shù)量，有效的促進(jìn)雌核發(fā)育[1，24]。開放當(dāng)天和開放前1 d的黃瓜雄花經(jīng)過不同劑量輻射后授粉，對坐果率影響不大，但是單倍體胚產(chǎn)率以輻射開放前1 d雄花授粉效果更好[25]。

6 離體胚挽救

由于輻射花粉誘導(dǎo)雌核發(fā)育過程中敗育胚的比例相當(dāng)高，所以常利用離體胚挽救技術(shù)提高誘導(dǎo)率。

Sauton等[1]發(fā)現(xiàn)，甜瓜幼胚在 MS+0.2 mg·L-16-BA+0.15 mg·L-1活性炭的培養(yǎng)基上進(jìn)行胚搶救更容易發(fā)育成胚狀體。孫玉宏等[26]在甜瓜離體胚挽救試驗(yàn)中也得到相同結(jié)論，同時(shí)研究表明，輻射授粉后12 d左右的甜瓜果實(shí)中的可搶救的胚的數(shù)量較高。Custer等[27]研究發(fā)現(xiàn)，幼胚發(fā)育到心形胚階段在適宜的培養(yǎng)基（E20A培養(yǎng)基含0.01 mg·L-1IAA）上進(jìn)行胚珠離體挽救，可以提高單倍體胚的誘導(dǎo)率。Kurtar等[4]在西葫蘆離體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)球形胚、箭狀胚和桿狀胚可以發(fā)育形成單倍體，僅有53.8%魚雷形胚和23.1%的心形胚發(fā)育成單倍體，其余的魚雷形胚、心形胚及子葉形胚及畸形胚則發(fā)育成雙單倍體。Sari等[3]研究表明，西瓜離體胚挽救的最佳時(shí)間為輻射授粉后3～4周，即多數(shù)胚為心形胚時(shí)單倍體誘導(dǎo)率高。裴曉利等[8]研究表明，黃瓜適宜的離體胚挽救時(shí)期也為授粉后3～4周，此時(shí)單倍體胚誘導(dǎo)率較高，且單倍體再生植株生長發(fā)育正常。

7 倍性鑒定與植株再生

7.1 染色體加倍

秋水仙素（秋水仙堿）是染色體加倍的常用試劑，Sari等[28]用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%和1.0%秋水仙素處理西瓜單倍體植株 1、2、4、6 h，結(jié)果表明 0.5%秋水仙素處理4 h或1.0%秋水仙素處理2 h均可獲得二倍體植株。

7.2 倍性鑒定

瓜類二倍體植株與單倍體、三倍體、四倍體在形態(tài)上有比較明顯的差別[29]。主要表現(xiàn)在子葉、真葉的形狀和顏色，花的形狀和顏色，果實(shí)形狀以及種子的形態(tài)，這些形態(tài)差異是從外觀上用目測法鑒別瓜類多倍體的較為可靠的指標(biāo)。Sari等[30]研究比較了2個(gè)西瓜品種二倍體及其單倍體植株的田間表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)單倍體植株的葉面積、莖長度、莖粗度顯著低于二倍體，單倍體植株的雌、雄花也明顯小于二倍體，單倍體雄花中沒有花粉粒，而二倍體則有。

Sari等[30]研究表明，單倍體西瓜植株的氣孔長度、直徑和保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的數(shù)目分別為17～18、10～12 μm 和 6～7 個(gè)，而二倍體約為 23～24、18 μm和11～12個(gè)。根據(jù)保衛(wèi)細(xì)胞的大小、單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的數(shù)目，可以有效區(qū)分倍性。

流式細(xì)胞測定法采用掃描細(xì)胞光度儀（也叫倍性分析儀）迅速測定葉片單個(gè)細(xì)胞核內(nèi)DNA含量，根據(jù)DNA含量的曲線圖推斷細(xì)胞的倍性。特別是在離體培養(yǎng)過程中，試管中的芽或小植株很小和很嫩時(shí)，僅用l cm2的樣品就能鑒定出材料倍性[28，31]。

7.3 植株再生

查丁石[19]將萌發(fā)的12個(gè)甜瓜幼胚移植到MS+20.0 mg·L-1葡萄糖+3.0 mg·L-1瓊脂固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得4株單倍體植株幼苗。單倍體植株通過莖節(jié)切段進(jìn)行增殖培養(yǎng)，10周后獲得54株生根再生植株。張永兵等[14]研究表明，甜瓜單倍體幼苗的頂芽或腋芽分化增殖最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-16-BA，生根最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg·L-1IBA。

8 問題與展望

利用花粉輻射和離體胚挽救技術(shù)獲得瓜類單倍體植株是一個(gè)較為成功的途徑，眾多國內(nèi)外學(xué)者研究了一些影響因素，如基因型、輻射劑量、輻射劑量率、植株生長環(huán)境、花粉發(fā)育階段、離體胚挽救時(shí)間、胚發(fā)育時(shí)期、染色體加倍、倍性鑒定和植株再生技術(shù)等，并取得了一些重要進(jìn)展，如親本基因型和輻射劑量是決定花粉輻射技術(shù)的關(guān)鍵因素；不同作物的適宜輻射劑量有差異，因此，選擇合適的基因型和適宜的輻射劑量是誘導(dǎo)單倍體胚成敗的關(guān)鍵。植株生長環(huán)境和花粉發(fā)育階段對單倍體誘導(dǎo)率同樣有重要影響，6—9月單倍體誘導(dǎo)率高于秋季；開放當(dāng)天和開放前1 d的雄花輻射授粉較好。輻射劑量率也極顯著影響單倍體誘導(dǎo)率，如用輻射劑量率為45.19 Gy·min-1處理西葫蘆時(shí)獲得的不飽滿種子或不同形態(tài)胚的數(shù)量最多，為61個(gè)；植株再生率和植株成活率也最高，分別是91.80%和49.18%。

采用離體胚挽救技術(shù)是因?yàn)檩椛浠ǚ壅T導(dǎo)雌核發(fā)育過程中敗育胚比例高，所以通過離體培養(yǎng)技術(shù)將幼胚轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上促進(jìn)進(jìn)一步發(fā)育，從而提高單倍體胚誘導(dǎo)率。因此，適宜的胚挽救時(shí)間和幼胚發(fā)育時(shí)期是離體胚挽救技術(shù)成敗的關(guān)鍵，胚挽救搶救時(shí)間因作物種類而異，但幼胚發(fā)育適期是心形胚和子葉形胚。

常用的加倍試劑是秋水仙素，一般濃度以0.5%～1.0%為宜。常用的倍性鑒定方法有：形態(tài)鑒別法、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目鑒定法和流式細(xì)胞測定法等，可根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)室建設(shè)條件選擇應(yīng)用。常用瓜類作物單倍體植株頂芽或腋芽分化增殖培養(yǎng)來建立植株再生體系。

利用花粉輻射和離體胚挽救技術(shù)已在黃瓜、西瓜、甜瓜、西葫蘆、南瓜、冬瓜等多種瓜類作物上獲得了單倍體植株。但目前輻射花粉誘導(dǎo)技術(shù)機(jī)制還不完全清楚，一種觀點(diǎn)是雙核花粉被射線照射時(shí)，生殖核尚未有絲分裂，受照射損傷生活力喪失，而此時(shí)如果營養(yǎng)核仍然有機(jī)能時(shí)，花粉仍能萌發(fā)，花粉管也能在花柱上生長，但因生殖核已無生活力，故只能刺激卵細(xì)胞分裂發(fā)育，而不能起到受精的作用；另一種觀點(diǎn)是雙核花粉被射線照射時(shí)，生殖核染色體異常分裂，造成2個(gè)精核之間染色體的不均衡分配，但是生活力并未喪失，仍可與卵細(xì)胞或者其他單倍體細(xì)胞結(jié)合，但是由于染色體的數(shù)目異常，不能與卵細(xì)胞或者其他單倍體細(xì)胞配對，導(dǎo)致無法正常受精，卻刺激了卵細(xì)胞或者其他單倍體細(xì)胞分裂產(chǎn)生單倍體。目前國內(nèi)外學(xué)者僅對胚挽救的時(shí)間、幼胚發(fā)育時(shí)期進(jìn)行了研究，對于影響離體胚挽救技術(shù)的其他因素如培養(yǎng)基、激素、溫度、活性炭、培養(yǎng)方式等有待于進(jìn)一步深入研究，以提高單倍體胚誘導(dǎo)率。