L-色氨酸的精制工藝

朱 撮 絲，　張 春 枝，　浦 軍 平

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連　116034；

2.張家港市華昌藥業(yè)有限公司， 江蘇 張家港　215600 )

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L-色氨酸的精制工藝

朱 撮 絲1，張 春 枝1，浦 軍 平2

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連116034；

2.張家港市華昌藥業(yè)有限公司， 江蘇 張家港215600 )

摘要:從飼料級(jí)L-色氨酸(L-Trp)粗品出發(fā)，將其進(jìn)一步精制成為食品級(jí)合格產(chǎn)品。對(duì)脫色溫度、脫色時(shí)間、活性炭的添加量進(jìn)行單因子試驗(yàn)和正交優(yōu)化，得到最佳工藝為脫色溫度80 ℃、脫色時(shí)間15 min、活性炭用量0.5%，產(chǎn)品透光率在95%以上，比旋光度達(dá)到要求(-30.0°～-32.5°)。采用離子交換樹(shù)脂提取母液中的L-Trp，從4種樹(shù)脂中選出適宜的離子交換樹(shù)脂，并進(jìn)行條件優(yōu)化，得到了最佳條件：HYA408作為理想的離子交換樹(shù)脂，樹(shù)脂裝柱體積與母液的裝柱量比為1∶2，氨水洗脫體積流量為1 mL/min，氨水濃度為0.5 mol/L。處理后母液的透光率達(dá)到90%，母液中L-Trp提取率達(dá)70%。

關(guān)鍵詞:L-Trp；脫色；離子交換樹(shù)脂

0引言

L-Trp廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料等方面，隨著市場(chǎng)需求量的日益增加，L-Trp具有廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。目前國(guó)內(nèi)L-Trp的工業(yè)化生產(chǎn)受到成本、技術(shù)的極大制約，產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求，需要大量進(jìn)口[3-4]；而在生產(chǎn)成本的構(gòu)成中，下游的分離純化成本占有相當(dāng)比例[5]，因此研究L-Trp 的分離純化工藝具有重要意義。梅叢笑等[6-7]利用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂提取發(fā)酵液中的L-Trp；桑麗花[8]應(yīng)用有機(jī)溶劑沉淀結(jié)晶方法精制L-Trp粗品;韋平和等[9]利用膜法去除L-Trp中的色素。在國(guó)內(nèi)，利用活性炭對(duì)L-Trp粗品進(jìn)行脫色還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)從飼料級(jí)L-Trp粗品出發(fā)，經(jīng)過(guò)脫色等工藝精制加工成食品級(jí)合格產(chǎn)品，并從脫色母液中提取L-Trp，進(jìn)一步提高L-Trp的收率。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料

飼料級(jí)L-Trp，黃色顆?；蚍勰?，希杰(印尼)有限公司。

1.1.2主要儀器

SGW-2自動(dòng)旋光儀，上海圖新電子科技有限公司；HB43-S鹵素水分測(cè)定儀，METTLER TOLEDO。

1.1.3主要試劑

767針劑活性炭,L-Trp標(biāo)準(zhǔn)品，D301樹(shù)脂,HYA408、HYA409、HYA511樹(shù)脂。

1.2方法

1.2.1L-Trp比旋光度的測(cè)定

稱取0.5 g L-Trp干燥品，放入50 mL容量瓶中，加入40 mL水，水浴加熱并使用超聲波清洗器以加速溶解，然后冰水中冷卻到20 ℃，定容到50 mL，用旋光儀測(cè)定旋光度，波長(zhǎng)為589 nm。

1.2.2L-Trp透光率的測(cè)定

稱取0.5 g干燥L(fēng)-Trp樣品，加2 mol/L鹽酸溶液20 mL溶解后，按照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在430 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定透光率。

1.2.3L-Trp濃度的測(cè)定

采用定量紙層析進(jìn)行測(cè)定。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定各洗脫液在520 nm波長(zhǎng)處的吸光度。按公式c=c0A/A0計(jì)算L-Trp濃度,其中c0是標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，A0是標(biāo)準(zhǔn)液的吸光值，A為樣品液的吸光值。

展開(kāi)劑為體積比為4∶1∶1的正丁醇-冰醋酸-水混合液，加入1 g茚三酮。洗脫液為體積比為39∶17的5%乙醇和0.2%硫酸銅混合溶液[10]。

1.2.4母液的處理

脫色母液進(jìn)行循環(huán)套用脫色至產(chǎn)品指標(biāo)不合格后，利用離子交換樹(shù)脂提取母液中的L-Trp，從4種樹(shù)脂中選出提取效果最好的樹(shù)脂，并進(jìn)行提取工藝優(yōu)化。

2結(jié)果與分析

2.1單因素法進(jìn)行脫色工藝的優(yōu)化

2.1.1活性炭用量對(duì)脫色效果的影響

1 000 mL純化水中加入20 g L-Trp粗品，在水浴鍋內(nèi)加熱到90 ℃，攪拌至溶解，分別添加0.1%，0.2%，0.35%，0.5%，0.8%的活性炭，在90 ℃下脫色30 min，用布氏漏斗趁熱抽濾，濾液在攪拌下冷卻到室溫靠溫差結(jié)晶，結(jié)晶完成后抽濾得到L-Trp晶體，用95%以上的乙醇浸泡1 h。L-Trp濕晶在鹵素水分測(cè)定儀上干燥至無(wú)水分。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)和旋光儀測(cè)定樣品的透光率，結(jié)果如圖1所示。

圖1　活性炭用量對(duì)脫色效果的影響

由圖1可以看出，在脫色溫度90 ℃、脫色時(shí)間30 min的條件下，隨著活性炭量的增加，透光率先增加后降低。活性炭超過(guò)一定的量后透光率有下降的趨勢(shì)，并且過(guò)多的活性炭有可能增加L-Trp的損失，以致降低色氨酸的收率。因此，最佳活性炭用量為0.5%，經(jīng)檢測(cè)比旋度符合標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.2溫度對(duì)脫色效果的影響

分別在50，60，70，80，90 ℃條件下脫色30 min，活性炭用量為0.5%，其他條件不變。檢測(cè)產(chǎn)品的透光率，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　溫度對(duì)脫色效果的影響

如圖2所示，溫度低于70 ℃時(shí)脫色效果不理想，透光率較低。溫度在70～90 ℃，脫色效果較好，透光率變化不大。L-Trp常溫下在水中溶解度為1.1%，溫度的增加有利于增大溶解度，從而提高脫色釜的利用率和產(chǎn)品的精制效率，所以脫色溫度選擇80～90 ℃比較適宜，比旋度符合標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.3脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響

分別控制脫色時(shí)間為5，12，20，30，45 min，活性炭用量0.5%，脫色溫度90 ℃，其他條件不變。檢測(cè)產(chǎn)品的透光率，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，脫色時(shí)間超過(guò)30 min,透光率降低，因此脫色時(shí)間30 min為最佳，比旋度符合標(biāo)準(zhǔn)。

2.2正交試驗(yàn)

2.2.1因素水平的選擇

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取三因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平表設(shè)計(jì)如表1所示。

圖3　脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響

表1　正交試驗(yàn)因素水平表

2.2.2正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

由表2、3可知，時(shí)間對(duì)脫色效果影響較大，其次為溫度，故選擇A2B1，在方差分析中Sc并入誤差列，C因素可根據(jù)經(jīng)濟(jì)性來(lái)選擇。綜合以上，最優(yōu)組合為A2B1C2,即脫色溫度為80 ℃、脫色時(shí)間為15 min，活性炭添加量為0.5%。所有的產(chǎn)品比旋光度都符合標(biāo)準(zhǔn)。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果

表3　方差分析表

2.3母液處理

2.3.1離子交換樹(shù)脂的選擇

選取4種弱堿性陰離子交換樹(shù)脂D301、HYA408、HYA409及HYA511進(jìn)行母液處理，脫色提取色氨酸。裝柱柱高都是20 cm (柱半徑為1.5 cm)，體積流量3 mL/min，母液體積為200 mL。分別檢測(cè)流出液的透光率和樹(shù)脂的吸附率，結(jié)果如圖4所示。

圖4　不同樹(shù)脂對(duì)L-Trp和色素的吸附效果

從圖4可以看出，D301和HYA511對(duì)母液脫色效果不明顯，透光率很低，并且樹(shù)脂對(duì)L-Trp都有一定的吸附，兩種樹(shù)脂都不能滿足要求。HYA409和HYA408對(duì)色素和L-Trp都有很強(qiáng)的吸附效果，因此選擇HYA409和HYA408繼續(xù)試驗(yàn)。

增加處理母液的體積，樹(shù)脂流出液每隔10 min 收集一次，分別收集10個(gè)樣液，并檢測(cè)溶液的透光率和L-Trp的含量，以確定HYA409和HYA408對(duì)色素和L-Trp的吸附能力，其他條件不變，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5樹(shù)脂HYA409和HYA408對(duì)L-Trp和色素的吸附效果

Fig.5AdsorptioneffectofHYA408andHYA409onL-Trpandpigments

收集的10個(gè)樣液中沒(méi)有色氨酸，但從圖5中可以看出，HYA409從第7個(gè)收集樣液開(kāi)始透光率下降，而HYA408樹(shù)脂流出液沒(méi)有變化，說(shuō)明HYA408對(duì)色素的吸附量較大，所以選用HYA408作為處理母液的樹(shù)脂。

2.3.2利用HYA408樹(shù)脂的提取條件優(yōu)化

2.3.2.1樹(shù)脂裝柱量的確定

選擇樹(shù)脂裝柱柱高為10，15，20，25，30cm，母液的加料量為300mL，洗脫體積流量控制在3mL/min，用0.5%的氨水進(jìn)行洗脫，每隔10min收集一次洗脫液，測(cè)定洗脫液的透光率，直至透光率小于80%時(shí)不再洗脫，分別測(cè)定不同柱高處理母液L-Trp的收率，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6　樹(shù)脂的裝柱量對(duì)L-Trp收率的影響

由圖6可以看出，樹(shù)脂上的L-Trp首先被洗脫下來(lái)，隨著洗脫時(shí)間的延長(zhǎng)，柱上的L-Trp減少，高濃度的氨水把上段吸附的色素洗脫下來(lái)，氨水濃度降低。色素可以被下端的樹(shù)脂重新吸附，樹(shù)脂裝柱柱高為20～30cm時(shí)L-Trp收率較高，考慮成本因素，選擇柱高20cm，計(jì)算得出每單位體積樹(shù)脂處理兩單位的母液。

2.3.2.2洗脫體積流量的確定

分別選擇0.25，0.5，1.0，2.0，3.0mL/min5種體積流量，用200mL的0.5mol/L氨水進(jìn)行洗脫。檢測(cè)洗脫液的L-Trp的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果如圖7所示，洗脫體積流量1mL/min為最佳。

圖7　體積流量對(duì)洗脫的影響

2.3.2.3洗脫濃度的確定

以0.25，0.5，1.0，2.0mol/L濃度的氨水進(jìn)行洗脫，洗脫體積流量1mL/min。每隔15min取一次洗脫液并測(cè)定透光率，直至洗脫液的透光率小于80%停止洗脫。測(cè)定各濃度下洗脫液中L-Trp的收率和質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果如表4所示。綜合考慮，選擇氨水濃度為0.5mol/L。

表4　氨水濃度對(duì)洗脫效果的影響

3結(jié)論

對(duì)脫色溫度、脫色時(shí)間、活性炭用量等條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化，得到最佳工藝為：脫色溫度80 ℃，脫色時(shí)間15 min，活性炭用量0.5%。產(chǎn)品透光率在95%以上，比旋光度達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。

用離子交換樹(shù)脂提取母液中的L-Trp，從4種樹(shù)脂中選出HYA408作為理想的離子交換樹(shù)脂，并進(jìn)行條件優(yōu)化，得到了最佳條件：樹(shù)脂裝柱量與母液的裝柱量比為1∶2，氨水洗脫體積流量為1 mL/min，氨水洗脫濃度為0.5 mol/L。處理后母液的透光率從0達(dá)到90%以上，母液中L-Trp 提取率達(dá)到70%。

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Refining process of L-tryptophan

ZHUCuosi1,ZHANGChunzhi1,PUJunping2

( 1.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2. Zhangjiagang Huachang Pharmaceutical Company Limited, Zhangjiagang 215600, China )

Abstract:To refine the feed-grade L-Trp to food-grade product, decolorization temperature, time and the added activated carbon were optimized by single factor test and orthogonal test. The optimum decolorization process was obtained at 80 ℃, 15 min and 0.5% activated carbon. Transmittance of the product was more than 95%, and the specific rotation was -30.0° to -32.5°. The result showed that HYA408 was the ideal ions exchange resin for extracting L-Trp from mother liquor, in which the ration of resin and mother liquor was 1∶2, flow rate was 1 mL/min, ammonia concentration was 0.5 mol/L. The transmittance and L-Trp extraction rate of the mother liquor were more than 90% and 70%, respectively.

Key words:L-Trp; decolorization; ions exchange resins

作者簡(jiǎn)介:朱撮絲(1989-)，男，碩士研究生；通信作者：張春枝(1963-)，女，教授.

基金項(xiàng)目:遼寧省高校聯(lián)合培養(yǎng)研究生項(xiàng)目(遼教發(fā)[2014154]).

收稿日期:2014-12-30.

中圖分類號(hào):TS202.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1674-1404(2016)01-0019-04