三七內(nèi)生菌的分離及其產(chǎn)皂苷發(fā)酵條件的優(yōu)化

劉 　 瑩，　侯 英 敏，　孫 業(yè) 兵，　張 宗 申，　金 朝 霞

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連　116034 )

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三七內(nèi)生菌的分離及其產(chǎn)皂苷發(fā)酵條件的優(yōu)化

劉 瑩，侯 英 敏，孫 業(yè) 兵，張 宗 申，金 朝 霞

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連116034 )

摘要:從三七的種子和根等部位分離三七內(nèi)生菌，分離純化后共獲得三七內(nèi)生菌11株。用薄層層析法對(duì)發(fā)酵液中皂苷類活性物質(zhì)進(jìn)行定性檢測(cè)，并采用香草醛-硫酸顯色法定量分析發(fā)酵液中皂苷的含量，篩選出一株可以產(chǎn)皂苷的內(nèi)生菌株N3。生理生化鑒定和16S rDNA基因序列同源性比對(duì)分析結(jié)果表明，此株菌為腸桿菌屬(Enterobacter)。通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定內(nèi)生菌株N3最適發(fā)酵條件為以蔗糖為碳源，牛肉膏為氮源，pH 7.0，溫度28 ℃。

關(guān)鍵詞:三七；內(nèi)生菌；皂苷

0引言

植物內(nèi)生菌是在一定階段或全部階段生活于健康植物根、莖、葉等組織內(nèi)的真菌或細(xì)菌，不會(huì)使宿主表現(xiàn)出外部病癥，是植物微生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成成分[1-3]。植物內(nèi)生菌主要可分為內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生放線菌三類[4-6]。目前已報(bào)道的植物內(nèi)生菌有假單胞菌屬、腸桿菌屬等[7]，可產(chǎn)生紫杉醇、抗菌活性物質(zhì)以及其他活性物質(zhì)，如生物堿、黃酮類、萜類、有機(jī)酸、木質(zhì)素等[8-9]。

內(nèi)生菌生活在藥用植物體內(nèi)，與藥用植物的“協(xié)同進(jìn)化”關(guān)系使一些內(nèi)生菌具有產(chǎn)生與植物相同或相似的生物活性物質(zhì)的能力，同時(shí)也形成了特殊的生活環(huán)境，使得內(nèi)生菌的分離難度較大。本實(shí)驗(yàn)以傳統(tǒng)的藥用植物三七為研究對(duì)象，成功分離三七內(nèi)生菌，對(duì)所得內(nèi)生菌發(fā)酵液中的皂苷進(jìn)行萃取后，篩選出可產(chǎn)皂苷的菌株，并對(duì)該內(nèi)生菌產(chǎn)皂苷的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)內(nèi)生菌發(fā)酵液提取皂苷，是實(shí)現(xiàn)內(nèi)生菌代替藥用植物的前提，能有效地解決我國(guó)某些珍稀藥用植物生長(zhǎng)緩慢和資源缺乏等問(wèn)題，對(duì)三七皂苷的實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用具有一定的意義[10]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料

三七鮮種子和根，購(gòu)于云南省文山市。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

馬鈴薯培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200 g，蔗糖20 g，水1 000 mL，pH自然。

淀粉培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g，硫酸銨2 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂1 g，氯化鈉1 g，碳酸鈣3 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.5。

1.1.2試劑與儀器

主要試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、馬鈴薯、蔗糖、可溶性淀粉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、碳酸鈣、乙醇、石油醚、正丁醇、齊墩果酸、香草醛、濃硫酸。

主要儀器：5048R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司；UV-2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司；1248UN超聲破碎儀，清華紫光股份有限公司。

1.2方法

1.2.1三七內(nèi)生菌的分離純化

取新鮮的三七種子，流水沖洗半小時(shí)后用升汞進(jìn)行表面消毒后，在無(wú)菌條件下，將種子去皮分別放于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基中于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為了保證分離的菌株是內(nèi)生菌，必須對(duì)消毒效果進(jìn)行檢查。檢查方法一是將消過(guò)毒的三七種子表面印跡于3種培養(yǎng)基上，置于相同條件下培養(yǎng)[11]；二是將最后一次沖洗種子的無(wú)菌水取適量涂于3種培養(yǎng)基表面，置于相同條件下培養(yǎng)[12]。

1.2.2內(nèi)生菌發(fā)酵液中皂苷的提取

將發(fā)酵液濃縮后進(jìn)行超聲破碎。向濃縮的發(fā)酵液中加入95%乙醇，使乙醇的終體積分?jǐn)?shù)為80%，靜置24 h。8 000 r/min離心，保留上清液，之后在60 ℃水浴鍋中加熱成膏狀，加入兩倍體積的水。用等體積石油醚除去色素等脂類物質(zhì)，除脂后的水溶液再加入等體積的水飽和正丁醇進(jìn)行萃取[13]。

1.2.3菌株發(fā)酵液中皂苷的TLC檢測(cè)

用微量移液器分別吸取定量的皂苷提取液點(diǎn)樣于硅膠薄層板上，以皂苷Re、Rg1、Rb1為標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，用正丁醇萃取過(guò)的培養(yǎng)基為空白對(duì)照；將點(diǎn)好樣的薄層板放入層析缸中的展開(kāi)劑內(nèi)，展開(kāi)劑為氯仿-甲醇-水(體積比7∶3∶0.5)4 ℃ 靜置12 h的下層溶液；顯色劑為10%硫酸溶液，于105 ℃加熱3～5 min顯色[14]。

1.2.4分光光度計(jì)法測(cè)定皂苷含量

1.2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取Re皂苷標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于25 mL容量瓶中，用甲醛定容搖勻。精取該溶液20，40，60，80，100 μL，分別置于10 mL具塞試管中，揮干溶劑，加入新配置的8%的香草醛-乙醇溶液0.5 mL，72%硫酸溶液5.0 mL，混勻閉塞后置于60 ℃恒溫水浴鍋中加熱10 min，立即用冰水冷卻10 min，搖勻，在560 nm處測(cè)吸光度[15-16]。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=0.867 5x+0.018 4，R2=0.991 5。

1.2.4.2樣品中皂苷含量的測(cè)定

取1 mL皂苷提取液分別置于10 mL具塞試管中，各3份，按照“1.2.4.1”的方法顯色測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算皂苷的含量，并計(jì)算平均值。

1.2.5菌種的鑒定

對(duì)內(nèi)生菌N3進(jìn)行生理生化鑒定以及DNA提取，由寶生物工程有限公司測(cè)序，將測(cè)得序列通過(guò)BLAST進(jìn)行同源性比較，并采用MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.6不同因素對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

1.2.6.1不同碳源對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)的OD600=1.0的菌種作為種子液，按5%的接種量分別接種于以10 g/L葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖和玉米粉為碳源的培養(yǎng)基中[17]，氮源為5 g/L的牛肉膏，無(wú)機(jī)鹽為5 g/L氯化鈉，在160 r/min、28 ℃的條件下培養(yǎng)3 d。測(cè)定內(nèi)生菌發(fā)酵液的菌體密度和皂苷含量。

1.2.6.2不同氮源對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

分別以5 g/L牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、硝酸銨、硫酸銨為氮源[18]，以10 g/L蔗糖為碳源，以5 g/L 氯化鈉為無(wú)機(jī)鹽，其他培養(yǎng)條件相同的情況下，測(cè)定內(nèi)生菌發(fā)酵液的菌體密度和皂苷含量。

1.2.6.3不同pH對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

以10 g/L的蔗糖為碳源，以5 g/L的牛肉膏為氮源，以5 g/L氯化鈉為無(wú)機(jī)鹽，將培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)為6.0，6.5，7.0，7.5和8.0，其他培養(yǎng)條件相同的情況下，測(cè)定內(nèi)生菌發(fā)酵液的菌體密度和皂苷含量。

1.2.6.4不同溫度對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

以10 g/L的蔗糖為碳源，以5 g/L的牛肉膏為氮源，以5 g/L氯化鈉為無(wú)機(jī)鹽，分別在23，25，28，30，33 ℃的搖床中培養(yǎng)，在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，測(cè)定內(nèi)生菌發(fā)酵液的菌體密度和皂苷含量。

2結(jié)果分析

2.1內(nèi)生菌菌種的分離純化與菌種鑒定

采取不同的培養(yǎng)基對(duì)三七內(nèi)生菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，共獲得11株內(nèi)生菌。將內(nèi)生菌發(fā)酵液中的皂苷經(jīng)正丁醇等有機(jī)溶劑提取后，進(jìn)行TLC檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，N3樣品顯色后呈現(xiàn)淺粉色條帶。由于皂苷經(jīng)薄層板顯色為紅色或淺粉色，可以初步斷定活性物質(zhì)為皂苷，并將此菌株命名為N3。

圖1　三七內(nèi)生菌N3發(fā)酵液中皂苷的TLC圖譜

對(duì)菌株N3進(jìn)行16S rDNA鑒定。以菌株N3的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2所示。由圖2可知，內(nèi)生菌N3與E.aerogenesNBRC 13534同源性較高，初步鑒定為腸桿菌屬(Enterobacter)。

圖2根據(jù)菌種N3及其相關(guān)菌種16S rDNA序列同源性建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

Fig.2Thephylogenetictreebasedonthe16SrDNAsequencesofstrainN3andrelatedstrains

2.2不同因素對(duì)內(nèi)生菌株生長(zhǎng)和皂苷含量的影響

2.2.1碳源

由圖3可知，以葡萄糖為碳源的發(fā)酵液菌體密度最大，以蔗糖為碳源的皂苷含量最高，而以蔗糖為碳源與以葡萄糖為碳源的發(fā)酵液菌體密度相差不大，說(shuō)明以蔗糖為碳源更有利于內(nèi)生菌株N3的皂苷合成，從而選擇蔗糖為最佳碳源。

圖3　碳源對(duì)菌N3生長(zhǎng)和生成皂苷的影響

2.2.2氮源

由圖4可知，以蛋白胨為氮源的發(fā)酵液菌體密度最大，以牛肉膏為氮源的發(fā)酵液皂苷含量最高，以蛋白胨為氮源的次之。可見(jiàn)，牛肉膏有利于內(nèi)生菌株N3產(chǎn)皂苷，選擇牛肉膏為最適氮源。

圖4　氮源對(duì)菌N3生長(zhǎng)和生成皂苷的影響

2.2.3初始pH

由圖5可知，當(dāng)初始pH為7時(shí)發(fā)酵液的菌體密度和皂苷含量達(dá)到最大值；隨著初始pH的增大，發(fā)酵液的菌體密度和皂苷含量也隨著降低，因此，選擇最適初始pH為7。

圖5　pH對(duì)菌N3生長(zhǎng)和生成皂苷的影響

2.2.4溫度

由圖6可知，內(nèi)生菌N3發(fā)酵液的菌體密度和皂苷含量隨著溫度的升高而增加，當(dāng)溫度達(dá)到28 ℃時(shí)，菌體密度和皂苷含量達(dá)到最大值；隨著溫度的繼續(xù)升高，菌體密度和皂苷含量降低，因此，培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)有利于內(nèi)生菌株N3的生長(zhǎng)和皂苷產(chǎn)生。

圖6　溫度對(duì)菌N3生長(zhǎng)和生成皂苷的影響

3結(jié)論

內(nèi)生菌與植物共同經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程，基因中含有與寄主植物相似的部分，使得內(nèi)生菌具有可產(chǎn)生與植物相同的活性物質(zhì)的能力。目前對(duì)內(nèi)生菌的研究主要集中在內(nèi)生菌對(duì)宿主植物的作用，而利用植物內(nèi)生菌特別是藥用植物內(nèi)生菌生產(chǎn)活性物質(zhì)的研究報(bào)道較少[20]。

本研究從三七植物組織中成功分離了11株內(nèi)生菌，其中一株經(jīng)鑒定為Enterobacter屬的內(nèi)生菌，EnterobacterN3可產(chǎn)皂苷，該菌以蔗糖為碳源、牛肉膏為氮源，在pH7、28 ℃條件下更有利于合成皂苷。通過(guò)對(duì)三七內(nèi)生菌的分離以及對(duì)內(nèi)生菌代謝產(chǎn)皂苷條件的初步探索，為下一步三七皂苷的實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用提供了充實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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Isolation of endophytes fromPanaxnotoginsengfor saponin production and optimization of its fermentation conditions

LIUYing,HOUYingmin,SUNYebing,ZHANGZongshen,JINZhaoxia

( School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Abstract:Eleven strains of endophytes were isolated from the seeds and roots of Panax notoginseng. One strain designated as N3 was proved to have the potential of producing sapoins in fermentation liquid. Strain N3 was identified as the genus Enterobacter based on its physiological-biochemical characteristic and 16S rDNA gene sequence analysis. Saponins could be synthesized with glucose and beef extract as the best carbon and nitrogen source respectively at pH 7.0 and 28 ℃.

Key words:Panax notoginseng; endophytes; saponins; fermentation condition

作者簡(jiǎn)介:劉 瑩(1989-)，女，碩士研究生；通信作者：金朝霞(1972-)，女，副教授.

收稿日期:2014-12-25.

中圖分類號(hào):TS201.2；Q939.97

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1674-1404(2016)01-0015-04