豬瘟病毒實驗室檢測方法研究進展

祖立闖,李 嬌，謝金文，李 峰，沈志強，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬瘟病毒實驗室檢測方法研究進展

祖立闖1,李 嬌1，謝金文2，李 峰2，沈志強1，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬瘟（Classical swine fever,CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病，豬瘟的發(fā)病率和死亡率都很高，是目前危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要病毒性傳染病之一[1]。多年來，我國自主研發(fā)的豬瘟兔化弱毒疫苗，對豬瘟的防控起到了重要作用。但隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；目焖侔l(fā)展，豬瘟出現(xiàn)新的變異和非典型的臨床癥狀，綜合防控難度逐步增加，給豬瘟的實驗室診斷提出了更高要求。鑒于此，筆者查閱大量相關(guān)資料，對豬瘟病毒的各種實驗室檢測方法進行綜述，以期為豬瘟的臨床和實驗室診斷提供參考。

1 RT-PCR方法

RT-PCR方法是豬瘟病毒實驗室診斷的常用方法，豬瘟病毒屬于RNA病毒，須先利用RNA提取試劑提取樣品中的病毒基因組RNA，在體外利用反轉(zhuǎn)錄酶將病毒基因組RNA合成cDNA，通過目的片段的體外PCR擴增和核酸電泳檢測實現(xiàn)病毒核酸的分子生物學(xué)檢測。檢測樣品可以是組織病料，也可以是血液樣品。陳本龍等[2]根據(jù)Genbank上發(fā)表的豬瘟病毒全基因組序列和豬瘟病毒強毒株和弱毒株的特異性基因序列各設(shè)計1條上游檢測引物，同時在保守序列區(qū)設(shè)計1條強毒株和弱毒株共用的下游引物，建立了一種能夠區(qū)別豬瘟強毒株和弱毒株的鑒別RTPCR檢測方法，強毒株和弱毒株分別擴增出680 bp和785 bp的特異性片段，該方法最低可以檢出0.5 pg的豬瘟病毒基因組RNA，有很高的特異性和敏感性，可以用于豬瘟的實驗室檢測和流行病學(xué)調(diào)查。

2 RT-nPCR方法

RT-nPCR方法為復(fù)合套式RT-PCR反應(yīng)，是在第1輪RT-PCR反應(yīng)內(nèi)部設(shè)計引物，以第1輪RTPCR擴增產(chǎn)物為模板進行第2輪PCR擴增反應(yīng)。吳旭錦等[3]建立了一種基于豬瘟病毒保守的E0基因的RT-nPCR檢測方法，該方法檢測CSFV cDNA含量的最低極限為6.7×10-5ng/L，與牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）和豬細小病毒（PPV）無交叉反應(yīng)，臨床檢測32份疑似豬瘟病毒感染組織病料，有12份呈現(xiàn)陽性，陽性率為37.5%。建立的RT-nPCR檢測方法靈敏度高、特異性強，可作為豬瘟病毒的臨床診斷方法，為豬瘟的防控提供參考。

3 熒光定量RT-PCR方法

熒光定量RT-PCR方法是在普通RT-PCR方法的基礎(chǔ)上引入熒光染料，通過熒光PCR儀進行RTPCR擴增，比普通的RT-PCR方法更加敏感。余以剛等[4]建立了豬瘟病毒野毒株和疫苗株熒光RT-PCR鑒別方法，該方法對野毒株和疫苗株的檢測靈敏度分別達到1 TCID50/mL和0.1 TCID50/mL，組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)在0.7%～2.2%之間，對豬肉、脾臟和血液病料進行豬瘟野毒檢測的陽性率分別為66.7%、60.0%、77.8%，而常規(guī)RT-PCR方法的陽性率分別為52.4%、40.0%、50.0%，檢出率比常規(guī)RTPCR方法要高。岳鋒等[5]根據(jù)豬瘟病毒5'UTR的保守序列設(shè)計特異性引物和TaqMan探針，建立了檢測豬瘟病毒的熒光定量RT-PCR方法，該方法最低檢測限為1×101拷貝/μL，檢測豬圓環(huán)病毒2型、豬細小病毒、豬偽狂犬病病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒均為陰性，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2%，具有特異、敏感、重復(fù)性好等優(yōu)點，為豬瘟病毒的臨床快速診斷提供了一種敏感、準(zhǔn)確和快速的檢測方法。

4 RT-LAMP方法

RT-LAMP是環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，是一種新型的、能在基層場地進行實時便捷診斷的豬瘟病毒檢測方法。通過設(shè)計豬瘟病毒特異性檢測引物和探針，恒溫進行擴增反應(yīng)，不需要PCR儀等特殊的儀器設(shè)備，通過加入熒光染料對擴增結(jié)果進行肉眼判讀，檢測結(jié)果直觀，適合臨床和基層應(yīng)用。袁向芬等[6]根據(jù)豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的保守序列分別設(shè)計一套LAMP檢測引物，在同一體系中進行RT-LAMP擴增，通過對反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了可以在63℃恒溫下進行豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征病毒同步檢測的RT-LAMP檢測方法，該方法與熒光定量RT-PCR檢測方法的符合率為100%，可以用于臨床兩種病原的同步快速檢測。朱俊靈等[7]根據(jù)豬瘟病毒NS5B基因設(shè)計特異性引物及生物素標(biāo)記探針，結(jié)合異硫氰酸熒光素標(biāo)記的擴增產(chǎn)物，建立了豬瘟病毒的RT-LAMP-LFD檢測方法，該方法可以特異檢出豬瘟病毒，對RNA的最低檢測限為50 pg，反應(yīng)快速，整個擴增反應(yīng)可在1 h內(nèi)完成，操作簡單，不需要PCR儀等復(fù)雜的儀器，滿足基層檢疫的需要，是一種新型的、能在基層場地進行實時便捷診斷的豬瘟病毒檢測方法。

5 ELISA方法

ELISA方法可以用于豬瘟病毒抗原和抗體的檢測，具有敏感、特異、操作簡便、快速的特點，其結(jié)果具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可以用于實驗室樣品的批量檢測。唐紅慧等[8]應(yīng)用進口豬瘟抗原/血清ELISA試劑盒對21份豬瘟成品疫苗進行病毒抗原含量測定，與兔體定型熱反應(yīng)相比，兩者符合率高達95.8%，表明ELISA方法可以用于豬瘟疫苗的病毒含量測定。蔣卉等[9]采用豬瘟抗體IDEXX ELISA檢測試劑盒對注射豬瘟病毒的家兔血清樣品進行抗體檢測，通過與家兔體溫反應(yīng)做比較，兩者有很高的正相關(guān)性，符合率為95.83%。ELISA方法可以用于豬瘟疫苗檢驗的替代方法。吳立君[10]應(yīng)用ELISA方法檢測豬瘟病毒抗體水平，通過ELSIA方法進行疾病檢測在臨床上有很好的應(yīng)用，對豬場的豬病防控起到很好的指導(dǎo)作用。

6 正向間接血凝方法

正向間接血凝方法的原理是將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當(dāng)大小的顆粒性載體的表面，然后與相應(yīng)抗體或抗原作用，在適宜的電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象。血凝試驗是紅細胞凝集試驗的簡稱，間接血凝試驗是以紅細胞作為載體的間接凝集試驗，用已知血凝抗原檢測未知血清抗體的試驗，稱為正向間接血凝試驗，在臨床檢驗中應(yīng)用廣泛。呂曉娟等[11]應(yīng)用正向間接血凝試驗檢測豬瘟免疫抗體，應(yīng)用該方法對5個規(guī)模養(yǎng)殖場和5個散養(yǎng)戶的200份血清樣品進行檢測，規(guī)模豬場抗體滴度集中在7 log2～8 log2之間，抗體滴度在5 log2～6 log2和9 log2～10 log2之間的較少，抗體不合格的只有4份，豬瘟抗體的合格率（抗體滴度≥5 log2）為96%，散養(yǎng)戶的豬瘟抗體滴度比較分散，抗體滴度在5 log2～6 log2和7 log2～8 log2之間的居多，9 log2～10 log2之間的很少，豬瘟抗體的合格率為85%。正向間接血凝方法操作簡單，所需要的儀器設(shè)備少，快速、靈敏、特異，適合基層推廣應(yīng)用。

7 小結(jié)與展望

豬瘟目前仍是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的頭號殺手，清除和控制豬瘟的發(fā)生，需要從多方面提高豬瘟的防控水平，構(gòu)建準(zhǔn)確、實用性高的豬瘟病毒檢測方法對實現(xiàn)豬瘟的凈化至關(guān)重要。本文詳細介紹了豬瘟病毒各種檢測方法的優(yōu)缺點以及最新研究進展，其中RT-PCR方法敏感性有限，容易漏檢，且不能定量；RT-LAMP方法靈敏度太高，易導(dǎo)致假陽性；熒光定量RT-PCR方法敏感性高、全封閉反應(yīng)，有效解決了RT-PCR方法容易漏檢以及RT-LAMP方法容易污染的問題，且能夠?qū)崿F(xiàn)對病毒含量的定量檢測，是目前豬瘟病毒檢測中最準(zhǔn)確的方法，雖然該方法對儀器、試劑、技術(shù)人員水平要求較高，但隨著我國基層獸醫(yī)實驗室建設(shè)的不斷完善，該方法將逐步成為豬瘟病毒臨床診斷最適合的方法。正向間接血凝方法和ELISA方法等血清學(xué)檢測方法不能區(qū)分強毒株感染抗體與疫苗免疫抗體，無法實現(xiàn)豬瘟病毒強毒株感染的鑒別診斷，但血清學(xué)方法操作簡單、高通量，可在豬瘟疫苗免疫后的抗體監(jiān)測中推廣應(yīng)用。故在臨床應(yīng)用中建議采用血清學(xué)方法對豬瘟疫苗免疫效果進行監(jiān)測，建議采用熒光定量RT-PCR方法對豬瘟病毒感染的疑似病例進行確診，進而提高豬瘟病毒檢測的準(zhǔn)確性，準(zhǔn)確淘汰強毒感染豬，減少免疫豬被誤殺，為豬瘟的凈化提供技術(shù)保障。

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[3]吳旭錦，朱小甫.豬瘟病毒RT-nPCR檢測方法的建立及陜西部分地區(qū)豬瘟病毒E0基因分子特征分析[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報，2014，42（10）：15-21.

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[5]岳鋒，朱艷平，銀梅，等.豬瘟病毒TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（6）：18-22.

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[9]蔣卉，戴志紅，王在時，等.豬瘟兔化弱毒疫苗效力檢驗替代方法研究Ⅰ家兔效力檢驗ELISA方法初探 [J].中國獸醫(yī)雜志，2013，49（5）：9-12.

[10]吳立君.用ELISA方法檢測豬瘟病毒抗體水平的操作步驟及注意事項[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2015（12）：26-27.

[11]呂曉娟，郭偉，趙佳，等.正向間接血凝試驗檢測豬瘟免疫抗體的應(yīng)用[J].畜牧與獸醫(yī)，2015，47（11）：138.

（編輯：柳青）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)06-0117-02

2016-09-22收稿，2016-10-11修回

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-06-022-15）

祖立闖（1981-），男，黑龍江賓縣人，助理研究員，碩士，主要從事動物疫病診斷技術(shù)研究.E-mail:zulichuang2008@126.com