傳染性喉氣管炎病毒疫苗的研究進展

崔健，楊明娟

（1.山東省臨朐縣檢驗檢測中心，山東 濰坊 262600；2山東省臨朐縣畜牧局，山東 濰坊 262600）

傳染性喉氣管炎病毒疫苗的研究進展

崔健1，楊明娟2

（1.山東省臨朐縣檢驗檢測中心，山東 濰坊 262600；2山東省臨朐縣畜牧局，山東 濰坊 262600）

傳染性喉氣管炎 (infectious laryngotracheitis，ILT)是由雞傳染性喉氣管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)引起的一種急性接觸性呼吸道雞的傳染病(朱旭東等[1]2005)，該病毒屬于皰疹病毒科，A型皰疹病毒屬，與皰疹病毒非常相似。該病第一次發(fā)生是1925年在美國的洛島，該病主要導(dǎo)致雞的死亡和產(chǎn)蛋量下降，目前已蔓延至全球各地，給養(yǎng)雞業(yè)造成很大的損失。

近年來，各國對畜禽的一些嚴重疫病采取了以消滅疫源為根本目的的檢疫-撲殺措施，但是還有許多動物傳染病仍依賴免疫接種作為主要的預(yù)防措施，例如傳染性喉氣管炎。目前，用于防治該病的疫苗多為常規(guī)疫苗，但是其往往存在諸多不足。為了解決這些問題和保障畜禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展，基因工程疫苗的研制越來越受關(guān)注。動物疫苗通常包括常規(guī)疫苗(滅活苗、弱毒苗)和基因工程疫苗(亞單位疫苗、基因疫苗、基因缺失疫苗、重組病毒活載體疫苗)袁子國[2](2008)。

1 常規(guī)ILTV疫苗

1.1 滅活疫苗 滅活疫苗制作方法簡單易行，使用安全又不受雛雞母源抗體的干擾。滅活苗制作原料復(fù)雜，又因其在免疫對象體內(nèi)不能復(fù)制，免疫需要的抗原量較大，必須采用注射免疫，使用成本較高，產(chǎn)生的免疫抗體在血清中維持的時間短暫。因用ILT滅活疫苗的免疫效果不夠好)，實際生產(chǎn)中預(yù)防ILT一般不使用。

1.2 弱毒疫苗 弱毒疫苗一般是將強毒株經(jīng)人工致弱而成。目前，該種類疫苗在畜禽養(yǎng)殖中應(yīng)用最多。該疫苗優(yōu)點是：弱毒疫苗所用毒株的毒力雖已弱化，但仍保持著原有毒株的抗原性，能在體內(nèi)繁殖但不引起發(fā)??；因而，免疫接種用量少，卻可產(chǎn)生足夠強的免疫力，免疫保護期長；該苗制作過程不需要加入佐劑，生產(chǎn)成本低，且動物產(chǎn)品(如肉類)的品質(zhì)無影響；接種時可以采用口服或點眼等方法接種，使用方便、人工成本低，適合用作家禽等大數(shù)量動物的免疫接種。缺點是：在研究和使用中，存在著減毒程度無法精確控制、使用時毒力可能返強等問題。有案例證明弱毒疫苗能夠返強成為可導(dǎo)致動物發(fā)病的強毒型，孫照剛等[3](2006)這也是該病無法有效控制的一個重要原因。因此，促使研制出毒力穩(wěn)定的弱毒苗成為面臨的首要課題。但是，ILTV只能在雞胚和原代細胞中正常復(fù)制，沒有發(fā)現(xiàn)有效的體外培養(yǎng)載體，致使沒有開發(fā)出新的弱毒疫苗。

2 基因工程ILTV疫苗

2.1 亞單位疫苗 楊海生等[4]（2009）亞單位疫苗是利用基因工程手段制備病原體的亞單位成分，只含有病原體的部分結(jié)構(gòu)，接種后不會在動物細胞內(nèi)繁殖所以也就不會感染動物導(dǎo)致發(fā)病，安全可靠。目前，對該病亞單位疫苗的研究主要集中在病毒糖蛋白上，因為這些蛋白分子可引起體液和細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。用提純的ILTV GB基因編碼的205kb糖蛋白復(fù)合物給雞做免疫注射，達到100%保護率。這是因為該蛋白是ILTV的主要免疫原，是一種跨膜蛋白，在病毒粒子囊膜的外層上，在病毒感染和進入機體細胞的過程中起關(guān)鍵作用，能誘導(dǎo)細胞免疫和體液免疫。這種疫苗雖有相當?shù)谋Ｗo力，但其產(chǎn)品很難保持天然免疫原的立體結(jié)構(gòu)，使其免疫效果與常規(guī)疫苗相比差距還比較大。

2.2 基因缺失疫苗 利用基因工程技術(shù)去除病毒復(fù)制非必需的與毒力相關(guān)的基因，是基因工程疫苗研究開發(fā)的熱點領(lǐng)域，具有良好的應(yīng)用前景?！柏i偽狂犬病毒TK基因缺失疫苗”是第一個獲得美國FDA批準的投入實際應(yīng)用的基因工程苗，為ILTV基因缺失疫苗的研制提供了有力的參考。研究證明，TK基因是ILTV復(fù)制非必需基因，其缺失后毒力降低，使用安全性提高，但在生產(chǎn)中還未大面積應(yīng)用。由于ILTV基因缺失苗克服了弱毒疫苗毒力偏強、接種后機體反應(yīng)強等缺點，具有毒株不易返強復(fù)制能力未明顯降低、免疫原性和安全性良好的優(yōu)點。另外，ILTV野毒株在雞體內(nèi)產(chǎn)生胸苷激酶，而免疫動物不產(chǎn)生該酶，據(jù)此就能將自然感染的雞和免疫的雞區(qū)分開，因此TK基因缺失苗可作為標記疫苗使用(智海東等[5]，2000)。該疫苗的應(yīng)用將為凈化動物種群、消滅某些傳染病帶來可能。

2.3 重組病毒活載體疫苗 孫照剛等[3](2006)ILTV的活載體疫苗主要有兩種方式：一是把ILTV的主要抗原基因插入到其它合適的活載體病毒中，如將GB基因等插入雞痘病毒中的重組疫苗(王云峰等[6]，2004)；二是以致病基因缺失的ILTV當做活載體，通過插入表達外源抗原基因構(gòu)建二價或多價疫苗。ILTV因其基因組中非必需的外源基因含量多，從而具備制備多價疫苗的活載體的條件。下面重點介紹ILTV作為活載體進行基因同源重組而插入外源基因作為多價疫苗的研究進展。

2.3.1 UL50(dUTPase)基因 該基因在動物自身細胞中普遍存在，缺失其的ILTV會借助分裂期細胞中的dUTPase仍可進行復(fù)制。孫照剛等[3](2006)第一次證實ILTV UL50基因不是毒力相關(guān)基因和病毒復(fù)制必需基因。將AIV HA H5基因片段插入UL50區(qū)造成了缺失，并以HCMV IE為啟動子進行了表達。實驗還發(fā)現(xiàn)，這些基因插入方向的不同對HA基因的表達無影響。使用表達H5的缺失UL50的ILTV接種雞后，于康震等[7]（2001）能從這些雞體內(nèi)檢測出抗ILTV和AIV HA的抗體，但滴度較低。這些雞可以抵抗強AIV毒株和ILTV毒株的攻擊。

2.3.2 ICP4孫照剛等[3](2006)同源基因 把B-gal標記基因插入其基因中，經(jīng)傳代5次后，經(jīng)驗證該外源標識基因能夠穩(wěn)定的傳給下一代，也就是得到了重組體病毒。重組體病毒與野毒相比噬斑外觀有所不同，周圍形成較少的多核體細胞。

2.3.3 gM基因(UL10) 各種皰疹病毒中UL10基因功能各有不同。對ILTVDNA中UL10實施了缺失，孫照剛等[3](2006)仍然能表達GFP蛋白。從而證明ILTV在細胞內(nèi)的復(fù)制，UL10基因是非必需的。

2.3.4 UL22下游ORFA-E基因 研究證明，孫照剛等[3](2006)UL22下游ORFA-E基因在細胞中復(fù)制對ILTV來說是非必需的，但也可以正常表達。分別在這些基因中插入了GFP基因和表達它們所需的元件，得到了5個重組的病毒。它們能在雞腎細胞(CEK)中體外培養(yǎng)時成功復(fù)制，孫照剛等[3](2006)但是它們只在雞肝癌細胞(LMH)上生長復(fù)制時產(chǎn)生噬斑，但與其親本不同的是噬斑較小、滴度較低。其中，形成噬斑的能力缺失ORF-C基因的最小，缺失ORF-B的與親體毒株差別不大。

2.3.5 UL0基因 孫照剛等[3](2006)在UL0位點插入兩個抗原基因EGFP和AIV的HA(H7)，再分兩組進行對比：一組是帶FGFP和HA(H7)的缺失UL0的ILTV重組子，另一組是不帶外源基因的。結(jié)果是：缺失UL0的ILTV重組子在細胞體外培養(yǎng)中的復(fù)制與其親本株基本相同；另一組缺失UL0的EGFP或HA(H7)重組子的復(fù)制能力降低，在LMH細胞中形成的噬斑顯著比其親本株小；表達AIV HA的缺失UL0的ILTV和只缺失UL0的重組ILTV毒力均降低，被接種雞臨床癥狀不明顯，在康復(fù)雞體內(nèi)不易檢測到病毒。被接種雞能抵御ILTV強毒和致死性H7亞型AIV攻擊。以上說明，在重組ILTV UL0位點插入表達AIV的HA抗原基因能制作抗ILTV和AIV的二聯(lián)活病毒疫苗。

2.3.6 UL23(TK)基因 張馨月等[8](2007)在TK基因內(nèi)部插入B-gal基因，利用TK基因啟動子，在與ILTV共同感染細胞時，發(fā)現(xiàn)這部分外源基因表達明顯加強。李義平[9](2004)利用SV40啟動子表達大腸埃希氏菌B-gal基因，重組后獲得了缺失TK基因的ILTV。實驗證實，在缺失TK基因的情況下ILTV仍能正常復(fù)制，且其復(fù)制能力與親代株差不多，并預(yù)測ILTV能作為活載體使用。在ILTV中插入了B-gal基因、TK基因缺失，利用豬偽狂犬病毒gX基因啟動子，孫照剛等[3](2006)SV40多聚腺苷酸做尾巴進行表達。Han等用強、弱毒株為親本株，分兩組將GFP基因插入TK基因序列，獲得兩株缺失TK基因的ILTV，并分析和比較了其的毒力和免疫效果。結(jié)果顯示，在細胞中的復(fù)制能力兩株重組子與其親本株相當，感染能力有所降低，都能使免疫雞不受ILTV強毒感染。

2.3.7 UL44(gC)基因 孫照剛等[3](2006)構(gòu) 建了兩種質(zhì)粒分別在SV40和CMV啟動子作用下表達NeoR和B-gal基因，它們的兩臂都由ILTV gC基因構(gòu)成。因此，發(fā)現(xiàn)gC基因有可能是在外源基因插入位點中較為能高效表達抗原蛋白的點為之一。因ILTV一般是經(jīng)粘膜感染，更易刺激機體釋放IgA抗體，用作病毒疫苗的活載體具相當?shù)膬?yōu)越性。

2.4 基因疫苗 潘曉斌[10](2008)將編碼能引起保護性免疫反應(yīng)的病原體抗原的基因與含有真核啟動子的質(zhì)粒DNA連接后直接導(dǎo)入動物體內(nèi)，在機體內(nèi)表達相應(yīng)的抗原蛋白，誘導(dǎo)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)抗體的免疫保護作用?；蛞呙鐑?yōu)點是：生產(chǎn)工藝簡單、易于大量生產(chǎn)、造價低廉，不易變質(zhì)、質(zhì)量可控、免疫期長，運輸和儲存方便。其表達產(chǎn)物雖然分子量較小，但由于在宿主細胞內(nèi)部，可刺激免疫系統(tǒng)即產(chǎn)生細胞免疫又產(chǎn)生體液免疫，免疫效果與弱毒活疫苗差不多，易于做成多聯(lián)苗，發(fā)展前景良好。孟松樹[11](2000)對預(yù)先接種了分別含有ILTV王崗株GB、GC、GD基因的重組空載體質(zhì)粒及真核表達質(zhì)粒分的雞，進行攻毒試驗。獲得79%免疫保護率。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒刺激機體產(chǎn)生了免疫反應(yīng)。因此，謝菲[12](2008)ILTV基因疫苗可以作為預(yù)防ILT的補充措施。在原種雞場中，不用弱毒疫苗避免引起潛伏感染，再配合使用活病毒載體疫苗可能開辟出一條根除ILT的新途徑。

3 結(jié)語

因弱毒疫苗可能引起的殘留毒力潛伏感染及易返強等特點，使ILT的防治一度成為養(yǎng)禽業(yè)遭遇的重大困難。因基因疫苗比傳統(tǒng)苗具有很多優(yōu)勢，王曉麗等[13](2008)隨著分子生物學和基因工程的發(fā)展，使基因工程疫苗的研制日益受到重視。但是，國內(nèi)ILTV基因疫苗的研究和報道較少，孫新峰[14](2008)與之研制有關(guān)的質(zhì)粒、啟動子、增強子、內(nèi)含子和免疫佐劑等的選擇，多個目的基因插入同一載體后是否互相干擾以及經(jīng)不同方式接種后引起的免疫機理和效果等諸多問題還需進一步研究，基因工程疫苗真正投入應(yīng)用的路還很長，但相信隨著研究的深入，能夠解決上述問題，從而設(shè)計研制出畜牧生產(chǎn)中急需的理想基因苗，消滅ILT甚至更多傳染病成為可能。

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S858.312.4

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1673-1085（2016）10-0051-04

2016-09-21