一種適宜針刺研究的多囊卵巢綜合征胰島素抵抗模型的研制*

林 鶯，許金榜，黃鳴清，于志文，紀(jì) 峰，黃黎珊

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福州 350122;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510006;3.福建省婦幼保健院，福州 350001)

【針灸研究】

一種適宜針刺研究的多囊卵巢綜合征胰島素抵抗模型的研制*

林 鶯1，2，許金榜3△，黃鳴清1，于志文1，紀(jì) 峰1，黃黎珊1

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福州 350122;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510006;3.福建省婦幼保健院，福州 350001)

目的:建立一種適宜針刺研究的多囊卵巢綜合征胰島素抵抗動(dòng)物模型。方法:雌性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為來(lái)曲唑灌胃聯(lián)合高脂膳食組、來(lái)曲唑灌胃常規(guī)飼料組和對(duì)照組，觀察體質(zhì)量、動(dòng)情周期、卵巢組織學(xué)變化，測(cè)定血清性激素、血脂、空腹血糖和空腹胰島素濃度并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。結(jié)果:來(lái)曲唑灌胃大鼠卵巢呈多囊樣改變，聯(lián)合高脂膳食組與對(duì)照組比較，體質(zhì)量明顯增加，血清T、LH、FINS和HOMA-IR以及血脂水平均顯著增高。結(jié)論:來(lái)曲唑灌胃聯(lián)合高脂膳食能夠成功誘導(dǎo)PCOS胰島素抵抗模型，避免皮下注射給藥方式對(duì)針刺效應(yīng)的干擾，適合針刺研究。

針刺;來(lái)曲唑;高脂飲食;胰島素抵抗;多囊卵巢綜合征

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期婦女常見(jiàn)的婦科內(nèi)分泌疾病，以持續(xù)性無(wú)排卵、雄激素過(guò)多和胰島素抵抗為特征，是女性不排卵性不孕癥的主要病因［1］。胰島素抵抗是PCOS的核心病理機(jī)制，它會(huì)導(dǎo)致PCOS患者超重和肥胖，加重 PCOS的內(nèi)分泌和代謝紊亂，還會(huì)引起PCOS遠(yuǎn)期代謝并發(fā)癥如2型糖尿病、心血管疾病等［2-3］。PCOS胰島素抵抗已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

針刺治療PCOS具有促排卵、改善胰島素抵抗的作用。建立一種適宜針刺研究的多囊卵巢綜合征胰島素抵抗動(dòng)物模型，對(duì)進(jìn)一步研究針刺作用機(jī)制具有重要意義。

常用的PCOS造模方法如雄激素法、雄激素 +人絨毛膜促性腺激素(hCG)法、雌激素法、來(lái)曲唑法、胰島素+hCG法、孕激素+hCG法等均采用皮下注射或皮下埋植給藥方式造模，有類(lèi)似針刺穴位的作用，因此不太適宜針刺效應(yīng)及機(jī)理研究。灌胃給藥方式構(gòu)建的 PCOS動(dòng)物模型比較適合針刺研究。目前來(lái)曲唑(letrozole)灌胃是誘導(dǎo) PCOS模型的一種較為成熟的造模方法，但該造模方法不能誘導(dǎo)典型的胰島素抵抗病理［4-5］。研究表明，單純高脂膳食能誘發(fā)大鼠肥胖、糖脂代謝紊亂［6］。本研究采用來(lái)曲唑灌胃結(jié)合高脂飼料喂養(yǎng)，成功誘導(dǎo)多囊卵巢綜合征胰島素抵抗模型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)條件

3周齡SPF級(jí)SD雌性大鼠18只，體質(zhì)量68～90 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司(合格證號(hào)2007000571938)。大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為PCOS-IR組、PCOS組和對(duì)照組各6只。

實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所為福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF實(shí)驗(yàn)室(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào) SYXK(閩)2014-0005)，溫度22～23℃，濕度50% ～60%，清潔飼養(yǎng)，給水充分，環(huán)境安靜，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境符合清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)要求。

1.2 藥物和試劑

來(lái)曲唑片(LETROZOL TABLETS，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，產(chǎn)品批號(hào) 15011956國(guó)藥準(zhǔn)字H19991001);羧甲基纖維素鈉(Sodium carboxymeth ylcellulose美 國(guó) SIGMA-ALDRICH 公 司，批 號(hào)1002004956);高脂飼料(D12492，5.24kal/g，供能比:蛋白20%，碳水化合物20%，脂肪60%)，對(duì)照飼料(D12450-B，3.85kal/g，供能比:蛋白 20%，碳水化合物70%，脂肪10%)，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心加工配送;卵泡刺激素放免試劑盒、黃體生成素放免試劑、睪酮放免試劑、雌二醇放免試劑、孕酮放免試劑、胰島素放免試劑盒(天津市協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司);拜耳1455型血糖儀(德國(guó)拜耳有限公司)。

1.3 造模方法

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，PCOS-IR組給予高脂飼料喂養(yǎng)12周，第6周齡時(shí)開(kāi)始每日灌胃來(lái)曲唑溶液(來(lái)曲唑1mg/kg·d溶于0.5%CMC-Na溶液中)，連續(xù)9周;PCOS組常規(guī)飼料喂養(yǎng)12周，第6周齡時(shí)開(kāi)始每日灌胃來(lái)曲唑溶液(配置方法同PCOS-IR組)，連續(xù)9周;對(duì)照組常規(guī)飼料喂養(yǎng)12周，第6周齡時(shí)開(kāi)始每日灌胃0.5%CMC-Na溶液，連續(xù)9周。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 大鼠動(dòng)情周期及體質(zhì)量增長(zhǎng)情況 大鼠灌胃8周后每天早上陰道涂片，10%福爾馬林固定，HE染色，顯微鏡下觀察動(dòng)情周期的變化，連續(xù)10 d;每周測(cè)量大鼠的體質(zhì)量并記錄、繪制大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)變化曲線。

1.4.2 血脂及血清性激素 大鼠灌胃達(dá)9周后于20∶00開(kāi)始禁食，次日晨8∶00鼠尾采血，拜耳1455型血糖儀測(cè)空腹血糖，2%戊巴比妥鈉(0.2 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈采血 5～8 ml，離心后收集血清，BECMAN全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL);放射免疫法檢測(cè)促卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)和睪酮(T)、胰島素(INS)。計(jì)算HOMA-IR指數(shù)(HOMA－IR=FINS×FPG/22.5)。

1.4.3 卵巢組織學(xué)檢查 卵巢組織4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，以4 μm厚度切片，常規(guī)脫蠟、水化后蘇木素染色15 min，1%鹽酸酒精分化，1%伊紅溶液染色、脫水、透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察病理組織學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠動(dòng)情周期變化

PCOS-IR組與PCOS組大鼠陰道涂片染色鏡檢結(jié)果顯示均處于動(dòng)情間期時(shí)相，僅見(jiàn)大量白細(xì)胞，偶見(jiàn)少量角化細(xì)胞，提示無(wú)排卵。對(duì)照組仍保持規(guī)律的動(dòng)情周期。

2.2 卵巢病理切片

圖1顯示，對(duì)照組大鼠卵巢可見(jiàn)不同發(fā)育階段的卵泡及多個(gè)黃體。PCOS-IR組與PCOS組大鼠的卵巢次級(jí)卵泡減少，囊狀卵泡和閉鎖卵泡增多，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少，白膜增厚，卵巢呈多囊樣改變，無(wú)成熟卵泡，無(wú)黃體和白體。

圖1 3組大鼠卵巢病理切片圖(HE×40)

2.3 性激素水平

表1顯示，PCOS-IR組大鼠的血清T、FSH水平與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，血清LH、PRL、P水平與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，符合多囊卵巢綜合征生殖內(nèi)分泌異常的特征。

2.4 體質(zhì)量及胰島素抵抗指數(shù)

表2圖2顯示，3組大鼠實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PCOS-IR組大鼠的體質(zhì)量在高脂喂養(yǎng)至8周開(kāi)始明顯增加，喂養(yǎng)至15周時(shí)顯著增高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001); PCOS-IR組大鼠的空腹血糖與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，空腹胰島素差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，HOMA-IR指數(shù)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，符合多囊卵巢綜合征代謝異常的特征。

表1 3組大鼠性激素水平比較

表2 3組大鼠體質(zhì)量與胰島素抵抗指數(shù)比較

圖2 3組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)趨勢(shì)圖

2.5 血脂水平

表3顯示，PCOS-IR組大鼠的血清TC水平與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，血清 LDL水平與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與對(duì)照組比較，PCOS-IR組大鼠的血清TG、HDL水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，符合多囊卵巢綜合征脂代謝紊亂特征。

表3 3組大鼠血脂水平比較

3 討論

針刺改善PCOS胰島素抵抗已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，建立合適的PCOS-IR動(dòng)物模型對(duì)進(jìn)一步深入研究針刺作用機(jī)理具有重要意義。在常用的PCOS造模方法中，雌激素法造模不表現(xiàn)明顯的胰島素抵抗特征，其他如雄激素法、雄激素+人絨毛膜促性腺激素(hCG)法、胰島素 +hCG法、孕激素 + hCG法等，造模動(dòng)物都會(huì)有不同程度的胰島素抵抗(IR)表現(xiàn)，其中脫氫表雄酮法(DHEA)最為常用，該法造模時(shí)間短、重復(fù)性好，有明顯的糖代謝異常表現(xiàn)，但體質(zhì)量無(wú)明顯變化;睪酮造模法動(dòng)物直接皮下注射或埋植給藥及出生前雄激素化均可構(gòu)建 PCOS模型并表現(xiàn)出明顯的IR;孕激素+hCG法所需時(shí)間較短，模型 PCOS特征持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，糖耐量異常表現(xiàn)明顯，但體質(zhì)量無(wú)明顯變化;胰島素+hCG法大鼠空腹血糖及胰島素水平升高，但由于加入了外源性胰島素，因此不適合于 IR研究。研究表明單獨(dú)的高脂飼料喂養(yǎng)，大鼠有明顯的糖代謝異常和 IR相關(guān)的肥胖表現(xiàn)，但其性激素水平變化不明顯，無(wú)法構(gòu)建 PCOS的生殖內(nèi)分泌異常特征［7］。因此，采用雄激素聯(lián)合高脂飼料法可以克服各自的不足，構(gòu)建典型的PCOS-IR模型。有學(xué)者［8-9］采用頸部皮下注射丙酸睪丸酮配合高脂喂養(yǎng)8周成功誘導(dǎo)大鼠PCOS胰島素抵抗模型。雖然上法制備的動(dòng)物模型具有典型的 PCOS生殖內(nèi)分泌異常以及胰島素抵抗特征，但由于給藥均采用皮下注射或皮下埋植方式，有類(lèi)似針刺穴位的作用，因此不太適宜針刺效應(yīng)及機(jī)理研究。

選擇灌胃給藥方式誘導(dǎo)的模型較為適宜針刺研究。來(lái)曲唑灌胃誘導(dǎo)多囊卵巢綜合征模型是目前較為成熟的造模方法，一般采用 6周齡大鼠來(lái)曲唑1mg/kg/d灌胃21 d即可造成PCOS模型，但此模型胰島素抵抗的病理特征不典型［10］39。我們借鑒丙酸睪丸酮配合高脂喂養(yǎng)造模思路，采用來(lái)曲唑灌胃聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)的方式誘導(dǎo)PCOS-IR模型。

從陰道涂片、卵巢形態(tài)以及生殖內(nèi)分泌激素的改變來(lái)看，來(lái)曲唑灌胃(PCOS組和PCOS-IR組)能誘導(dǎo)典型的 PCOS生殖內(nèi)分泌改變，如陰道涂片無(wú)明顯的動(dòng)情周期，卵巢見(jiàn)多個(gè)呈囊性擴(kuò)張的卵泡，顆粒細(xì)胞層減少，未見(jiàn)黃體，血清 T、LH均顯著增高。來(lái)曲唑灌胃聯(lián)合高脂喂養(yǎng)(PCOS-IR組)體質(zhì)量增長(zhǎng)較PCOS組及正常對(duì)照組顯著，特別是在喂養(yǎng)至第10周時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)明顯差異，F(xiàn)INS、HOMA-IR、TC、LDL均顯著增高，說(shuō)明來(lái)曲唑灌胃聯(lián)合高脂飲食可成功誘導(dǎo)大鼠PCOS胰島素抵抗模型。該模型避免了皮下注射給藥方式對(duì)針刺效應(yīng)的干擾，因此可作為研究針刺干預(yù)多囊卵巢綜合征胰島素抵抗效應(yīng)的動(dòng)物模型。

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Study on a Rat Model of Polysystic Ovarian Syndrome with Insulin Resistance Suitable for Acupuncture Research

LIN Ying1，2，XU Jin-bang3△，HUANG Ming-qing1，YU Zhi-wen1，JI Feng1，HUANG Li-shan1
(1.Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350122，China;2.Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China;3.Fujian Maternity and Children Health Hospital，F(xiàn)uzhou 350001，China)

Objective:To establish letrozole and high-fat diet-induced polycystic ovary syndrome(PCOS)animal model with insulin resistance(IR)for acupuncture research.Methods:Female Sprague-Dawley rats were divided into 3 groups:the PCOS-IR group(treated with letrozole and high fat diet)，the PCOS group(treated with letrozole and normal diet)and the Control group.The weight，reproductive cycles and ovarian morphology were observed.The serum sex hormone levels，insulin levels，lipid profile，fasting plasma glucose(FPG)，fating insulin(FINS)were measured.The homeostasis modelinsulin resistence index(HOMA-IR)were assessed.Results:Compared with control group，both PCOS-IR group and the PCOS group showed completely acyclic estrus cycles and polycystic ovaries.Between the two letrozole-treated groups，the PCOS-IR group had the most serious insulin resistance(IR).PCOS-IR group exhibited elevated weight with higher levels of total cholesterol concentrations and low density lipoprotein and higher concentrations of T、LH、FINS and increased HOMA-IR.Conclusions:Letrozole with high-fat diet rat model showed ovarian and metabolic features of PCOS-IR，it might be suitable for acupuncture research for avoiding administration of injection.

Acupuncture;Letrozole;High-fat diet;Insulin resistance;Polycystic ovary syndrome

R711.75

:B

:1006-3250(2016)03-0398-03

2015-06-17

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (81302998)-基于microRNA調(diào)控胰島素信號(hào)通路的多囊卵巢綜合征痰證分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究;福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015Y0002)-基于 microRNA調(diào)控雄激素受體通路觀察針?biāo)幦斯ぶ芷诏煼ǜ纳贫嗄衣殉簿C合征排卵障礙的臨床與機(jī)制研究;福建省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(wzfg201304)-基于microRNA調(diào)控胰島素信號(hào)通路觀察針?biāo)幦斯ぶ芷诏煼ǜ纳铺禎裥投嗄衣殉簿C合癥胰島素抵抗臨床研究;福建省衛(wèi)生計(jì)生委青年科研課題(2014-1-20)-檢測(cè)血清miR-29表達(dá)觀察針?biāo)幦斯ぶ芷诏煼▽?duì)痰濕型多囊卵巢綜合征胰島素抵抗的臨床療效

林 鶯(1980-)，女，福建福州人，講師，在讀博士，從事針灸調(diào)節(jié)女性生殖神經(jīng)內(nèi)分泌的基礎(chǔ)與臨床研究。

△通訊作者:許金榜(1980-)，男，副主任醫(yī)師，Tel:0591-88563873，E-mail:Jinbangxu@yahoo.com。