扶腎降濁方對系膜增生性腎炎大鼠腎小管間質(zhì)損害的保護(hù)作用*

蘇瑋蓮，李國霞，寧志芬，李春雨，李經(jīng)秀，魏曉露

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193;2.天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070)

扶腎降濁方對系膜增生性腎炎大鼠腎小管間質(zhì)損害的保護(hù)作用*

蘇瑋蓮1，2，李國霞2△，寧志芬2，李春雨2，李經(jīng)秀2，魏曉露2

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193;2.天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070)

目的:觀察扶腎降濁方對系膜增生性腎炎大鼠腎小管間質(zhì)損害的保護(hù)作用。方法:采用系膜增生性腎炎模型，將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、扶腎降濁方組、貝那普利組。分別觀察實(shí)驗(yàn)16周和20周末扶腎降濁方對系膜增生性腎炎大鼠的腎功能、腎組織病理變化的影響，并設(shè)貝那普利為陽性對照組。結(jié)果:16周和20周末模型組及用藥組大鼠血液肌酐、尿素氮、β2-微球蛋白和24 h尿蛋白均明顯高于正常組，中藥組、貝那普利組均較模型組明顯降低;模型組腎小管損害明顯，腎間質(zhì)纖維化顯著，且隨造模時(shí)間延長病變程度逐漸加重，中藥組和貝那普利組腎小管損害較輕，腎間質(zhì)局灶性纖維化。結(jié)論:扶腎降濁方能改善系膜增生性腎炎大鼠腎功能，減輕腎小管間質(zhì)損害，具有腎臟保護(hù)作用。

系膜增生性腎炎;腎小管間質(zhì)損害;扶腎降濁法;保護(hù)作用

系膜增生性腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)是常見的原發(fā)性腎小球疾病的病理類型。腎小管間質(zhì)損害是腎小球腎炎由炎癥的啟動(dòng)進(jìn)展至腎臟纖維化的中間環(huán)節(jié)，腎小球腎炎進(jìn)展至腎臟纖維化大多已不可逆轉(zhuǎn)，而對其中間環(huán)節(jié)即腎小管間質(zhì)損害進(jìn)行早期有效的干預(yù)，則可能大大改善腎小球腎炎進(jìn)展至腎功能衰竭的預(yù)后。本文采用MsPGN模型，延長造模時(shí)間至20周，使之逐漸發(fā)展成腎小管間質(zhì)損害，以探討扶腎降濁方對系膜增生性腎炎腎小管間質(zhì)損害的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康雄性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量(150±10) g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào) SCXK-(軍)2009-003)。

1.2 藥物與試劑

葡萄球菌腸毒素B(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供，批號(hào)121101)，完全弗氏佐劑(批號(hào) SLBC5083)和不完全弗氏佐劑 (批號(hào)SLBB9817)均購自美國 Sigma公司，牛血清白蛋白(天津潤泰科技發(fā)展有限公司，AMRESCO分裝，批號(hào)201410)，Masson染液(南京建成科技有限公司，批號(hào)20131018)，伊紅染液(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品，批號(hào)KGA231)，蘇木素染液(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品，批號(hào) KGA223)，中藥扶腎降濁方由山茱萸、生黃芪、白花蛇舌草、丹參、鬼箭羽、益母草組成，天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供，按比例稱取后水煎提取經(jīng)濃縮干燥制成粉末，每克粉末含生藥4.06 g(批號(hào)20120810)。西藥鹽酸貝那普利片(北京諾華制藥有限公司，批號(hào)X1801)。

1.3 主要儀器

全自動(dòng)生化分析儀，東芝 TBA-120(日本東芝TOSHIBA公司);自動(dòng)脫水機(jī)Leica ASP200、包埋機(jī)Leica EG1150、切片機(jī)Leica RM2245(LEICA公司);奧林巴斯BX51顯微鏡成像系統(tǒng)(奧林巴斯公司);日本日立HT7700透射電鏡。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物模型的建立及分組 健康雄性Wistar大鼠經(jīng)普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，尿蛋白、紅細(xì)胞均陰性，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、扶腎降濁方組、西藥貝那普利組各12只。系膜增生性腎炎模型造模方法參照劉震［1］等報(bào)道的方法加以改進(jìn)。實(shí)驗(yàn)第1天起模型組、中藥組、西藥組以牛血清白蛋白20 mg配成水溶液，隔日灌胃1次，正常組以等量生理鹽水隔日灌胃，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束;實(shí)驗(yàn)第1天模型組、中藥組、西藥組經(jīng)皮下分點(diǎn)注射完全弗氏佐劑0.2ml，第8天注射不完全弗氏佐劑0.2 ml，第8天及第15天尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素B (0.4 mg/kg體質(zhì)量)各1次，均造模成功;正常組以等量生理鹽水注射。

1.4.2 給藥方法 治療組自造模第1天開始給藥，中藥組以中藥煎劑灌胃(51.5 g·kg－1/d)，西藥組以鹽酸貝那普利灌服(4 mg·kg－1/d)，模型組及正常組以等量生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)期間，各組動(dòng)物自由飲食、飲水，分別于造模第16、20周末處死動(dòng)物。

1.4.3 24 h尿蛋白定量 檢測16周、20周末各組大鼠24 h尿蛋白，將每只大鼠分別置于大鼠代謝籠中，留尿期間禁食，自由飲水，記錄24 h尿量，用日本東芝 TBA-120全自動(dòng)生化分析儀檢測尿蛋白濃度，并計(jì)算24 h尿蛋白定量。

1.4.4 血液生化指標(biāo)檢測 分別于造模第16、20周末處死大鼠，腹主動(dòng)脈取血，日本東芝TBA-120全自動(dòng)生化分析儀分別檢測血清中尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(serum creatinine，Scr)、β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2-MG)。

1.4.5 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 分別于造模第16、20周末處死大鼠，迅速打開腹腔，將取出的兩腎組織各取大小不等的兩部分，一部分腎組織用4%多聚甲醛溶液固定，進(jìn)行石蠟包埋切片，切片厚度為4μm，將組織切片按常規(guī)方法進(jìn)行 HE、Masson染色。另一部分腎組織用2.5%戊二醛溶液固定，并按常規(guī)方法進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，根據(jù)方差齊性結(jié)果選擇單因素方差分析法進(jìn)行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果

表1、2顯示，造模16周和20周末，模型組和用藥組BUN、Scr、β2-MG均比正常組大鼠增高，模型組增高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。隨著造模時(shí)間延長，各指標(biāo)值逐漸增高，腎功能逐漸損害。經(jīng)中藥和西藥治療后，大鼠BUN、Scr、β2-MG值均較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，中西藥比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠腎功能檢測結(jié)果(±s)

表1 各組大鼠腎功能檢測結(jié)果(±s)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:##P＜0.01

組別 鼠數(shù) BUN(mmol/L)Scr(μmol/L) 16周 20周 16周 20周6.56±0.55 7.05±0.44 27.80±1.04 26.66±2.54模 型 組 6 11.46±0.88＊＊ 13.00±1.30＊＊ 47.25±8.80＊＊ 55.23±5.15＊＊扶 腎 降 濁 方 組 6 8.36±0.49＊＊## 9.17±0.58＊＊## 35.63±4.05＊＊## 40.98±2.21＊＊##貝 那 普 利 組 6 8.23±0.36＊＊## 8.99±0.80＊＊## 29.96±3.09＊＊## 38.48±4.45＊＊##正常組6

表2 各組大鼠β2-MG檢測結(jié)果(mg/L，±s)

表2 各組大鼠β2-MG檢測結(jié)果(mg/L，±s)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:##P＜0.01

組別 鼠數(shù) 16周 20周6 0.28±0.12 0.56±0.10模 型 組 6 0.87±0.10＊＊ 1.04±0.26＊＊扶腎降濁方組 6 0.64±0.17＊＊## 0.98±0.32＊＊##貝 那 普 利 組 6 0.61±0.06＊＊## 0.92±0.14＊＊##正常組

2.2 各組大鼠24 h尿蛋白定量結(jié)果

表3顯示，造模16、20周末，模型組大鼠 24 h尿蛋白定量明顯升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，中藥組和西藥組較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，尿蛋白定量隨著造模時(shí)間延長顯著增高;中西藥比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 腎臟病理學(xué)變化

圖1～3顯示，普通光鏡下可見正常組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，未發(fā)現(xiàn)變性和壞死，間質(zhì)無纖維化及炎細(xì)胞浸潤。第16周末，模型組腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、顆粒變性、壞死，部分小管完全萎縮。Masson染色顯示，有間質(zhì)纖維化伴炎細(xì)胞浸潤;中藥組和西藥組小管輕度變性、壞死，間質(zhì)有少量纖維組織增生，同時(shí)伴炎細(xì)胞浸潤。第20周末，模型組小管變性、壞死程度進(jìn)一步加重。Masson染色顯示，腎小球和腎間質(zhì)有大量纖維組織增生及大量炎細(xì)胞浸潤，中藥組和西藥組小管變性較模型組輕，間質(zhì)有局灶性纖維化及較多的炎細(xì)胞浸潤。

表3 各組大鼠24 h尿蛋白檢測結(jié)果(mg/dl，±s)

表3 各組大鼠24 h尿蛋白檢測結(jié)果(mg/dl，±s)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:##P＜0.01

組別 鼠數(shù) 16周 20周6 8.22± 2.28 9.14± 2.97模 型 組 6 82.56±30.50＊＊ 106.43±14.35＊＊扶腎降濁方組 6 46.76± 7.85＊＊## 70.00± 7.07＊＊##貝 那 普 利 組 6 44.56± 6.82＊＊## 71.89±10.76＊＊##正常組

圖1 16周末各組腎組織HE染色病理圖片(HE staining ×200)

圖2 20周末各組腎組織HE染色病理圖片(HE staining ×200)

圖3 20周末各組腎組織Masson染色病理圖片(Masson staining，×200)

圖4 顯示，透射電鏡觀察可見正常組腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，基底膜厚度正常，足突排列整齊，線粒體清晰，結(jié)構(gòu)完整。第16、20周末模型組腎小管上皮細(xì)胞基底皺褶擴(kuò)張，基底膜結(jié)構(gòu)不完整，增厚明顯，腎小球系膜細(xì)胞增多，系膜基質(zhì)增多，腎間質(zhì)基質(zhì)和膠原纖維增多，線粒體腫脹破壞，大量溶酶體出現(xiàn)。中藥組和西藥組小鼠腎小球基底膜輕度增厚，足突融合現(xiàn)象不明顯，腎小球系膜細(xì)胞少量增多，腎間質(zhì)基質(zhì)輕度增多。隨著造模時(shí)間的延長，腎小管間質(zhì)損害程度逐漸加重。

圖4 20周末各組腎組織透射電鏡病理圖片

3 討論

由慢性腎小管間質(zhì)損害導(dǎo)致的腎間質(zhì)纖維化病變已成為幾乎所有腎臟疾病的共同最終結(jié)局［2］。系膜增生性腎小球腎炎以彌漫性腎小球系膜細(xì)胞增生和不同程度系膜基質(zhì)增多為主要病理特征。當(dāng)腎小球系膜病變較輕時(shí)，腎間質(zhì)和腎小管基本正常，但是在腎小球系膜病變嚴(yán)重時(shí)，腎間質(zhì)即可出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤及纖維化，伴腎小管萎縮［3］。由此可見，腎小管間質(zhì)損害系腎小球腎炎進(jìn)展至腎臟纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，早期防治腎小管間質(zhì)損害對于防止腎小球腎炎進(jìn)展惡化有重要作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對腎小管間質(zhì)損害的防治尚無特效療法，而中醫(yī)藥在逆轉(zhuǎn)腎小管間質(zhì)損害、延緩慢性腎功能衰竭進(jìn)展方面具有較好的臨床療效。李國霞［4］等研究表明，中醫(yī)藥對腎小管間質(zhì)損害大鼠腎臟具有一定的保護(hù)作用，因此研究及開發(fā)中醫(yī)藥對腎小管間質(zhì)損害的防治作用具有較高的價(jià)值。

根據(jù)中醫(yī)理論，慢性腎小球腎炎發(fā)展到腎小管間質(zhì)損害階段，脾腎兩虛(尤其是腎虛)是其發(fā)病的內(nèi)在因素，濕熱瘀濁是其遷延不愈的病理基礎(chǔ)［5］。本研究前期工作表明，扶腎降濁方可抑制COLⅠ和COLⅢ在腎臟的積聚以減輕腎間質(zhì)纖維化［6］。故本研究采用扶腎降濁方治療系膜增生性腎炎腎小管間質(zhì)損害，探究其保護(hù)作用機(jī)理。研究結(jié)果顯示，造模16和20周末，大鼠血清肌酐和尿素氮水平升高，24 h尿蛋白定量增高，提示腎功能受損。血中 β2-MG幾乎完全從腎小球?yàn)V過，濾過的β2-MG 99.9%被近曲小管上皮細(xì)胞吸收并分解代謝。因此，正常人尿液中含量甚微，當(dāng)近曲小管受損時(shí)，尿液中 β2-MG含量就會(huì)增加。造模后大鼠β2-MG增高，提示腎小管受損。病理形態(tài)結(jié)果顯示，模型組腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、顆粒變性、壞死，個(gè)別小管完全萎縮，間質(zhì)局部纖維化，且隨著造模時(shí)間延長，腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)進(jìn)一步破壞，小管變性、壞死程度加重，腎小球和間質(zhì)有大量纖維組織增生及炎細(xì)胞浸潤。中藥組和貝那普利組大鼠血清肌酐、尿素氮、β2-MG和24 h尿蛋白均降低，腎功能明顯改善，較之模型組腎小管變性和間質(zhì)纖維化程度皆較輕。結(jié)果表明，扶腎降濁方可明顯改善患病大鼠腎功能，減輕腎臟病理改變，保護(hù)腎臟。

扶腎降濁方由山茱萸、生黃芪、白花蛇舌草、丹參、鬼箭羽、益母草6味中藥組成，山茱萸益肝腎之陰，斂精固澀;生黃芪補(bǔ)肺脾之氣，二藥相伍，使滋陰不至于呆膩，補(bǔ)氣不過于溫燥以扶腎固本;白花蛇舌草清熱利濕解毒;丹參、鬼箭羽、益母草活血化瘀，利水消腫，清除體內(nèi)久蘊(yùn)之濕熱、瘀濁等病理產(chǎn)物，恢復(fù)機(jī)體的正常代謝功能以治標(biāo)。諸藥合用，標(biāo)本兼治，既有整體調(diào)節(jié)又有對因治療，從而達(dá)到控制疾病進(jìn)展的目的。

［1］劉震，周樹錄，譚建三，等.大鼠系膜增殖型腎小球腎炎模型的改進(jìn)［J］.華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，27(2):182-184.

［2］Reilly RF，Bulger RE，Kriz W.Structrue-function relationships in the kidnety//Schirier RW.Diseases of the kidney and Urinary tract.8th ed［M］.Philadelphia:Lippincott William＆Wilkins，2007:2-53.

［3］王海燕.腎臟病學(xué)［M］.3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2012: 1016-1023.

［4］李國霞.系膜增生性腎炎大鼠腎小管間質(zhì)損害的相關(guān)因素及疏利少陽法之腎疏寧作用機(jī)理的研究［D］.天津:天津中醫(yī)學(xué)院，2005:1-153.

［5］李國霞，黃文政.系膜增生性腎炎腎小管間質(zhì)損害的中醫(yī)病因病機(jī)探討［J］.江蘇中醫(yī)藥，2008，40(4):12-13.

［6］蘇瑋蓮，李春雨，李國霞，等.扶腎降濁方對系膜增生性腎炎腎小管間質(zhì)損害大鼠COLⅠ及COLⅢ蛋白和基因表達(dá)的影響［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2014，48(12):80-84.

Protective Effect of Fushen Jiangzhuo Decoction on the Renal Tubular Interstitial Damage in Rats with Mesangial Proliferative Glomerulonephritis

SU Wei-lian1，2，LI Guo-xia2△，Ning Zhi-fen2，LI Chun-yu2，LI Jing-xiu2，WEI Xiao-lu2
(1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicice，Tiaojin 300193，China; 2.Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China)

Objective:To observed the effect of“supporting kidney to eliminate turbid fluid”prescription on protection of tubulointerstitial injury in rats with mesangial proliferative glomerulonephritis.Methods:Using mesangial proliferative glomerulonephritis model，rats were randomly divided into normal group，model group，TCM group and western medicine group.Experiments were observed for 16weeks and 20weeks of effect of TCM which can support kidney to eliminate turbid fluid on protection of tubulointerstitial injury in rats with mesangial proliferative glomerulonephritis，and set benazepril served as positive controls.Results After making model for 16weeks，20weeks，the rats blood creatinine，urea nitrogen，β2-MG and 24-hour urine protein of model group and TCM group were significantly higher than normal group，compared with the model group，TCM group and benazepril group were decreased significantly;Tubular damage，renal interstitial fibrosis were obviously observed on model group and increased with age，TCM group and benazepril group had less tubular damage，renal interstitial focal fibrosis.Conclusion:TCM which can support kidney to eliminate turbid fluid can improve the kidney function of the rats with mesangial proliferative glomerulonephritis，decrease the tubulointerstitial injury and protect the kidney.

Mesangial proliferative glomerulonephritis;Tubulointerstitial lesions;Supporting Kidney to Eliminate Turbid Fluid;Effect of protection

R285.5

:B

:1006-3250(2016)03-0342-03

2015-02-09

天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(11JCYBJC12800)-扶腎降濁法調(diào)控纖維化因子保護(hù)腎小管間質(zhì)損害的機(jī)理

蘇瑋蓮(1981-)，女，廣西人，講師，醫(yī)學(xué)碩士，從事中醫(yī)藥治療腎病的機(jī)制研究。

△通訊作者:李國霞(1967-)，女(滿族)，河北人，教授，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)藥治療腎病的機(jī)制研究，Tel:022-83336911，E-mail:liguoxia96@126.com。