云南黃連市售品質(zhì)量評(píng)價(jià)*

張德偉，封海霞，謝漢林，丁 博，牟臘梅

（1．重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 404000； 2．重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 401121；3．重慶三峽學(xué)院，重慶 404000； 4．重慶文理學(xué)院，重慶 402160）

云南黃連市售品質(zhì)量評(píng)價(jià)*

張德偉1，封海霞2，謝漢林3，丁 博3，牟臘梅4

（1．重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 404000； 2．重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 401121；3．重慶三峽學(xué)院，重慶 404000； 4．重慶文理學(xué)院，重慶 402160）

目的 建立測(cè)定云南黃連中黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿等單體生物堿和總生物堿含量的高效液相色譜（RP－HPLC）法和紫外分光光度（UV）法，比較不同商品來(lái)源云南黃連質(zhì)量的差異。方法 HPLC法采用色譜柱Venusil MP C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈－0．2%冰醋酸（三乙胺調(diào)pH＝5．05）梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm；UV法于349 nm波長(zhǎng)處測(cè)定總生物堿吸光度。聯(lián)合上述方法對(duì)10批云南黃連藥材進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行聚類分析。結(jié)果 黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿進(jìn)樣量分別在0．200 0～2．000 0，0．092 4～0．924 0，1．278 0～12．780 0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r≥0．999 5），平均加樣回收率依次為98．61%，97．35%，99．03%，RSD分別為1．28%，1．52%，1．19%（n＝6）。UV法測(cè)總生物堿質(zhì)量濃度在5．112～25．560 μg／mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。采用聚類分析能將不同產(chǎn)地的10批云連藥材分為3類。不同地區(qū)商品云南黃連生物堿含量存在顯著性差異。結(jié)論 該法準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，對(duì)市場(chǎng)上云南黃連的質(zhì)量狀況起到良好的評(píng)價(jià)作用，可為進(jìn)一步系統(tǒng)研究云南黃連奠定基礎(chǔ)。

云南黃連；黃連堿；鹽酸巴馬?。畸}酸小檗堿；總生物堿；高效液相色譜法；紫外分光光度法

云南黃連（Coptis teeta Wall．）又稱云連，為毛茛科黃連屬（Coptis）草本植物，產(chǎn)于云南西北部及藏東南地區(qū)，為我國(guó)傳統(tǒng)中藥黃連的源植物之一[1－2]。由于云連生長(zhǎng)環(huán)境要求極高，市場(chǎng)上售賣的藥材多以野生為主，由于長(zhǎng)期過度采挖和生境的破壞，云連資源越來(lái)越匱乏，已于2002年被列為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)中藥材[3]。云連味苦、性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效。研究表明，黃連藥材的主要成分為黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿等生物堿，尤其以小檗堿含量最高[4]。目前關(guān)于黃連中有效成分含量測(cè)定已有報(bào)道，但對(duì)市售不同區(qū)域產(chǎn)云南黃連的質(zhì)量評(píng)價(jià)未作考察。因此，筆者收集了不同地區(qū)的市售云連，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定了3種單體生物堿的含量，以及用紫外分光光度（UV）法測(cè)定總生物堿的含量，為云連質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，為更加系統(tǒng)全面地研究云南黃連奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司)，包括 G1311C四元泵，G1329B進(jìn)樣器，G1314F紫外檢測(cè)器；Mettler XP204型電子天平（瑞士）；TG18M型離心機(jī)（長(zhǎng)沙平凡儀器儀表廠）；圣德利超純水機(jī)；DFY－200型萬(wàn)能粉碎機(jī)；KQ－800DE型數(shù)控超聲波清洗器；UV－2501PC型紫外可見分光光度儀（島津）。黃連堿對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，含量為 98%）；鹽酸巴馬汀對(duì)照品（批號(hào)為 110732－201309）、鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)為 110713－201212），均供含量測(cè)定用，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。樣品（購(gòu)自云南、四川、重慶藥材批發(fā)市場(chǎng)，共10批）經(jīng)重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院周濃副教授鑒定為毛茛科植物云南黃連 Coptis teeta Wall．的干燥根莖，藥材粉碎后過40目篩，備用。

2 方法與結(jié)果

2．1 單體生物堿含量測(cè)定[5]

2．1．1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：VenusilMPC18（2）柱（250mm×4．6mm，5μm）；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0．2%冰醋酸（三乙胺調(diào)pH＝5．05），梯度洗脫（0→15 min→25 min→35 min→55 min，20%A→50%A→35%A→80%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：345 nm；流速：1．0 mL／min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30℃。在此條件下，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2．1．2 溶液制備

精密稱取黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇，分別制成質(zhì)量濃度0．1000，0．046 2，0．639 0 g／L的溶液，即得對(duì)照品溶液。稱取樣品粉末約0．1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加1%鹽酸甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，60℃溫浴30 min，超聲提取60 min，放冷，補(bǔ)足失重，搖勻，用前以4 000 r／min離心10 min，即得供試品溶液。

2．1．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取2．1．2項(xiàng)下對(duì)照品溶液2，5，10，15，20 μL，注入液相色譜儀，以進(jìn)樣量(X)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表1。

表1 3個(gè)單體生物堿的線性回歸方程

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的 RSD分別為1．2%，1．7%，0．8%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取用云南黃連(批號(hào)為S4，購(gòu)自成都市荷花池中藥材市場(chǎng))制備的同一供試品溶液，于0，2，4，8，12 h時(shí)進(jìn)樣10 μL。結(jié)果黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的 RSD分別為0．8%，1．1%，0．6%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取用云南黃連(批號(hào)為S4，購(gòu)自成都市荷花池中藥材市場(chǎng))0．1 g，依法平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量的 RSD分別為 1．4%，1．8%，0．9%（n＝6），表明方法重復(fù)性好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知含量的云南黃連(批號(hào)為S4，購(gòu)自成都市荷花池中藥材市場(chǎng))0．05 g，共6份，每份樣品加入適量黃連堿對(duì)照品10 mL、鹽酸巴馬汀對(duì)照品10 mL、鹽酸小檗堿對(duì)照品10 mL，揮干。按供試品溶液制備方法制備溶液，依法測(cè)定峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿平均回收率為98．61%，97．35%，99．03%，RSD分別為1．28%，1．52%，1．19%（n＝6）。

2．1．4 樣品含量測(cè)定

取10批云連，按2．1．2項(xiàng)下方法各制備3份供試品溶液，用0．22 μm微孔濾膜過濾后，進(jìn)樣量10 μL，依法測(cè)定峰面積，以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算云南黃連中黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果見表2。

2．2 總生物堿含量測(cè)定[6]

2．2．1 溶液制備

稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成0．639 g／L的溶液，即得對(duì)照品貯備溶液；精密量取2 mL，置25 mL容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，即得對(duì)照品溶液。稱取本品粉末約0．1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加1%鹽酸甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取60 min，放冷，補(bǔ)足失重，過濾，取濾液1．0 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，4 000 r／min離心10 min，即得供試品溶液。以相應(yīng)的試劑為空白溶液。

2．2．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密吸取2．2．1項(xiàng)下對(duì)照品溶液1，2，3，4，5 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，以相應(yīng)的試劑為空白，照 2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄ⅤA紫外－可見光光度法，于349 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A），以 A為縱坐標(biāo)、鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 A＝0．068C－0．019 3，r＝0．999 2 (n＝5)。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度在 5．112～25．560 μg／mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2．2．3 樣品含量測(cè)定

取2．2．1項(xiàng)下供試品溶液，照2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄ⅤA紫外－可見光光度法，依法測(cè)定計(jì)算。結(jié)果見表2。

表2 不同商品來(lái)源云南黃連中生物堿含量（mg／g，n＝3）

2．3 聚類分析

分別采用不同商品來(lái)源云連中生物堿含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行聚類分析。采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件的Ward法，選取平方Euclidean距離作為樣品度量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)10批樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，繪出樹狀圖。結(jié)果見圖2。

圖2 高效液相色譜法測(cè)定不同商品來(lái)源云南黃連中生物堿含量的聚狀分析樹狀圖

根據(jù)聚類分析結(jié)果，將10批樣品分為3類：第1類有6批藥材，即S1～S3及S7～S9，此類藥材中黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿及總生物堿（UV法測(cè)定）含量均低于均值，第2類有1批藥材，即S6，此類藥材中黃連堿和總生物堿（UV法測(cè)定）低于均值，其中總生物堿遠(yuǎn)低于均值，鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿略高于均值；第 3類有 3批藥材，即 S4，S5，S10，此類藥材中黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿及總生物堿（UV法測(cè)定）含量均高于均值。結(jié)果見表3。

表3 不同商品來(lái)源云連中生物堿含量聚類分析的不同組別各組分的平均含量（mg／g，n＝3）

3 討論

目前，市場(chǎng)上的黃連藥材中，以雅連、味連為主，云連栽培規(guī)模小、產(chǎn)量低，以野生為主[7]。本試驗(yàn)中收集不同地區(qū)商品藥材，測(cè)量其總生物堿含量，同時(shí)測(cè)定鹽酸小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀在各批次樣品中的含量。結(jié)果表明，不同地區(qū)經(jīng)銷的云連生物堿含量存在顯著性差異，特別是黃連堿含量差異較大。

黃連類藥材的有效成分主要為生物堿，化學(xué)成分復(fù)雜。在試驗(yàn)過程中，通過優(yōu)化提取溶劑、提取時(shí)間，調(diào)整流動(dòng)相、流速，更換色譜柱、變化柱溫等條件，確定了本研究中樣品的提取條件和色譜方法。結(jié)果表明，本方法簡(jiǎn)單易行、準(zhǔn)確靈敏，重復(fù)性好，可用于評(píng)價(jià)不同商品來(lái)源云連及相關(guān)產(chǎn)品的品質(zhì)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，市售云連來(lái)源復(fù)雜，質(zhì)量參差不齊。造成市售云連質(zhì)量差異的因素可能與來(lái)源、產(chǎn)地和生長(zhǎng)年限等有關(guān)[8－9]。人工種植云連作為市售云連藥材的主要來(lái)源，其種植來(lái)源問題亟需解決，種植藥材質(zhì)量也需要進(jìn)一步提升，才能從基源上確保云連的臨床用藥安全和療效。中藥材市場(chǎng)作為商品云連流通的一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，對(duì)云連質(zhì)量的影響不可忽視。建議相關(guān)部門應(yīng)該更嚴(yán)格管理藥材市場(chǎng)，控制好云連的市場(chǎng)準(zhǔn)入關(guān)口，盡量消除商品云連的摻偽現(xiàn)象，從而保證云連品質(zhì)。

[1]中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所．云南植物志:11卷[M]．北京:科學(xué)出版社，2000:180－183．

[2]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典（第二增補(bǔ)本）[M]．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2013:97－98．

[3]傅國(guó)立．中國(guó)植物紅皮書－稀有瀕危物[M]．北京:科學(xué)出版社，1992:522．

[4]王永占，沈 勇，史曉倩．HPLC法同時(shí)測(cè)定云黃連中四種生物堿的含量[J]．中國(guó)藥師，2013，16(7):947－949．

[5]彭 福，瞿顯友，鐘國(guó)躍，等．HPLC法測(cè)定黃連不同部位中6個(gè)生物堿[J]．中草藥，2012，43(3):509－512．

[6]趙梓辰，楊 麗，李雪蓮，等．正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選黃連總生物堿提取測(cè)定方法[J]．中藥與臨床，2015，6(2):28－29．

[7]楊艷娟，謝世清，楊生超，等．云南黃連的研究進(jìn)展[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(23):14 037－14 038．

[8]黃 驥，裴盛基，張明宇，等．云南黃連的生物學(xué)、生態(tài)學(xué)特性與地理分布研究[J]．云南植物研究，2004，26(3):255－266．

[9]黃 驥，龍春林．云南黃連的傳統(tǒng)種植及其在生物多樣性保護(hù)中的價(jià)值[J]．生物多樣性，2006，14(1):79－86．

Quality Assessment of Coptis Teeta Wall．from Different Markets

Zhang Dewei1,Feng Haixia2,Xie Hanlin3,Ding Bo3,Mu Lamei4
(1．Wanzhou Institute for Drug and Food Control,Chongqing,China 404000; 2．Chongqing Institute for Drug and Food Control,Chongqing,China 401121; 3．Chongqing Three Gorges University,Chongqing,China 404000; 4．Chongqing University of Arts and Sciences,Chongqing,China 402160)

Objective To establish a quantitative method for Coptisine,Palmatine hydrochloride,Berberine hydrochloride,Total alkaloid in Coptis teeta by HPLC and UV,and to compare the quality of products from different commercial sources．Methods The HPLC method used venusil MP C18chromatographic column(250 mm×4．6 mm,5 μm),mobile phase of acetonitrile to 0．2% glacial acetic acid (triethylamine pH＝5．05),gradient elution,detection wavelength of 345 nm;349 nm wavelength UV method in the determination of total alkaloids of absorbance．There were 10 samples detective and cluster analysis．Results The linear range of coptisine,palmatine hydrochloride,berberine hydrochloride were 0．200 0－2．000,0．092 4－0．924 0,1．278 0－12．780 0 μg(r≥0．999 5)．The average recovery rates were 98．61%，97．35%，99．03%，RSD＝1．28%，1．52%，1．19%(n＝6)．The UV method measured the mass concentration of total alkaloids showed a good linear relationship with absorbance in the range of 5．112－25．560 μg／mL．10 batches of different origin teeta herbs could be divided into 3 categories by cluster analysis．There were significant differences between different areas of goods teeta alkaloid content．Conclusion The method is accurate,reliable,repeated,which could be used in judge the quality of commercial Coptis teeta．

Coptis teeta;coptisine;palmatine hydrochloride;berberine hydrochloride;total alkaloid;RP－HPLC;UV

R284．1；R282．71

A

1006－4931(2016)03－0004－04

張德偉（1979－），男，漢族，大學(xué)本科，主管中藥師，主要從事中藥材品質(zhì)研究及成分分析工作，(電話)023－58152381。

2015－10－14)

*重慶三峽學(xué)院2014年度大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：2014020。