siRNA沉默胸腺素β4對(duì)鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響

謝紅梅，孟祥宇，孫天霞，張麗軒，趙　雨，曲 毅,2*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研究開發(fā)中心，長春 130117；2.吉林省食品藥品安全監(jiān)測中心，長春 130033)

siRNA沉默胸腺素β4對(duì)鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響

謝紅梅1，孟祥宇1，孫天霞1，張麗軒1，趙雨1，曲 毅1,2*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研究開發(fā)中心，長春 130117；2.吉林省食品藥品安全監(jiān)測中心，長春 130033)

摘要：目的利用siRNA干擾技術(shù)研究胸腺素β4(Tβ4)基因沉默對(duì)鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)增殖的影響。方法鹿茸MCS分為陰性對(duì)照組、siRNA-Tβ4轉(zhuǎn)染組2組。MTT檢測MSC增殖的變化，Real-time PCR檢測ILK、AKT及CyclinD1 mRNA表達(dá)量差異變化，Western blot檢測AKT及P-AKT蛋白含量變化。結(jié)果siRNA-Tβ4轉(zhuǎn)染組MSC增殖受到顯著抑制(P<0.01)；siRNA-Tβ4轉(zhuǎn)染組ILK、CyclinD1 mRNA表達(dá)量下調(diào)，AKT mRNA表達(dá)量不變；siRNA-Tβ4轉(zhuǎn)染組總AKT蛋白含量無變化，P-AKT蛋白含量減少。結(jié)論 Tβ4基因沉默能顯著抑制MSC增殖，并可能通過下調(diào)ILK、P-AKT及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1從而抑制MSC細(xì)胞增殖。

關(guān)鍵詞：RNA干擾；Tβ4；間充質(zhì)干細(xì)胞；ILK/AKT信號(hào)通路

鹿茸具有強(qiáng)壯機(jī)體、抗衰老、增加機(jī)體免疫力、抗炎、抗腫瘤、抗?jié)?、增?qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心腦血管系統(tǒng)等藥理作用[1-4]。前期研究[5-8]發(fā)現(xiàn)，在鹿茸快速生長時(shí)期，Tβ4高度表達(dá)。Tβ4是一個(gè)由43個(gè)氨基酸組成的小分子多肽，存在于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、加速血管生成、降低炎癥反應(yīng)、抑制凋亡和氧化損傷。鹿茸的生長依賴于鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的增殖與分裂。本研究以MSC為模型，通過RNA干擾技術(shù)，沉默MSC的Tβ4基因，觀察MSC 增殖及ILK/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，探討Tβ4沉默對(duì)MSC增殖的影響及其可能的機(jī)制，旨在為鹿茸快速生長研究探索新的途徑。

1材料

1.1主要試劑鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。Tβ4小干擾RNA(siRNA-Tβ4)和CY3-陰性對(duì)照小干擾RNA均為上海吉瑪基因股份有限公司設(shè)計(jì)合成。MTT為美國Amresco公司產(chǎn)品。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品。兔來源 p-AKTser473一抗和兔來源AKT1一抗均購買于Cell Signaling公司。鼠來源Tublin一抗、兔二抗和鼠二抗均購買Abcam公司。ECL顯色劑購自碧云天公司。

1.2siRNA的合成據(jù)前期獲得的鹿茸Tβ4mRNA 序列和siRNA設(shè)計(jì)原則，鹿茸Tβ4mRNA的siRNA序列為：正義鏈GCAUAGGGCGCAUAUATT；反義鏈UAUAUGCGCGCUCCUAUGCTT；陰性對(duì)照為吉瑪公司提供的錯(cuò)義siRNASCR序列。

2方法

2.1MSC細(xì)胞株的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染MSC細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長密度達(dá)到70%～80%時(shí)，0.25%胰酶消化，離心去胰酶。并用無血清無抗性的DMEM稀釋細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104cells/L，應(yīng)用電轉(zhuǎn)法進(jìn)行電轉(zhuǎn)染，siRNA濃度為100 nmol/L。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別接種96孔和6孔板,用于后續(xù)的細(xì)胞增殖檢測和信號(hào)通路研究。96 孔培養(yǎng)板每孔100 μL，每組6個(gè)復(fù)孔。6 孔培養(yǎng)板每孔2 mL，每組3個(gè)復(fù)孔。

2.2MTT檢測細(xì)胞增殖抑制率轉(zhuǎn)染6 h后，更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組和siRNA- Tβ4轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染48 h后每孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后置于酶標(biāo)儀上，在490 nm 波長下測各組吸光度(A)值。2.3Real-time PCR檢測ILK、AKT及CyclinD1 mRNA表達(dá)量差異變化用TRIzol法提取MSC細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，Tβ4以F:AAAACGGAAACGCAAGA、R:GATTTCACTGTCGTCCCAC；內(nèi)參基因β-Actin以F:CACCACAGCCGAGCGGGAAAT、R:CCGTGTTGGCGTAGAGGT為擴(kuò)增引物進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，在進(jìn)行Real-time PCR時(shí)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3組平行，利用2-Ct方法計(jì)算Tβ4基因在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組相對(duì)表達(dá)量。Real-time PCR檢測重復(fù)3次。

2.4Western blot檢測AKT及P-AKT蛋白含量變化提取細(xì)胞總蛋白后，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，一抗37 ℃孵育2 h，加入二抗室溫孵育1 h，ECL避光顯色，檢測AKT及P-AKT蛋白的表達(dá)，Tubulin為內(nèi)參。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)分析用SPSS 19.40統(tǒng)計(jì)軟件，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

3結(jié)果

3.1MTT檢測siRNA- Tβ4轉(zhuǎn)染MSC后增殖影響結(jié)果表明，siRNA- Tβ4轉(zhuǎn)染組MSC增殖受到顯著抑制，抑制率為(18.450 1±0.401 7)%。與陰性對(duì)照組比較，P<0.01。

3.2Real-time PCR檢測siRNA-Tβ4轉(zhuǎn)染MSC后AKT、CyclinD1及ILK表達(dá)影響結(jié)果表明，Real-time PCR檢測siRNA-Tβ4轉(zhuǎn)染組ILK、CyclinD1 mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)，與陰性對(duì)照組比較，P<0.01;AKT表達(dá)量變化與陰性對(duì)照組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3Western blot檢測AKT及P-AKT蛋白含量變化結(jié)果顯示，siRNA-Tβ4轉(zhuǎn)染組相對(duì)于對(duì)照組總的AKT蛋白含量無明顯變化，而P-AKT明顯減少，說明siRNA-Tβ4干擾的Tβ4表達(dá)促使磷酸化的AKT減少。

4小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)用siRNA干擾MSC中Tβ4表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)MSC的增殖被明顯抑制，表明Tβ4和MSC增殖密切相關(guān)，Tβ4在鹿茸快速生長中可能起重要調(diào)控作用。

在ILK/AKT信號(hào)通路中，當(dāng)ILK被激活時(shí)，將引起下游分子PKB、AKT或GSK-3的磷酸化效應(yīng)，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)影響下游基因表達(dá)，最終對(duì)細(xì)胞增殖和存活產(chǎn)生影響[9-10]。本研究表明Tβ4被沉默后，MSC中的ILK和CyclinD1 mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)，而AKT盡管在mRNA水平未發(fā)生表達(dá)變化，但翻譯后蛋白的磷酸化水平明顯下降。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，Tβ4可以促進(jìn)MSC增殖，可能的機(jī)制為激活I(lǐng)LK，進(jìn)而活化AKT，促進(jìn)下游CyclinD1的表達(dá)。此研究為后續(xù)鹿茸快速生長機(jī)制研究了奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]李和平.中國茸鹿品種(品系)的鹿茸化學(xué)成分[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,31(4):26-28.

[2]薄士儒,李慶杰,王春雨,等.鹿茸化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào),2010,14(4):243-248.

[3]翁梁,周秋麗,王麗娟,等.鹿茸多肽促進(jìn)表皮和成纖維細(xì)胞增殖及皮膚創(chuàng)傷愈合[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2001,36(1):817-820.

[4]董振,褚文輝,趙海平,等.鹿茸再生及其蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展[J].中國組織工程研究,2014,18(24):3931-3936.

[5]BOLLINOLLINI S,RILEY P R,SMART N.,et al.Thymosin β4:multiple functions in protection,repair and regeneration of the mammalian heart[J].Expert Opin Biol Ther,2015,15(1):63-174.

[6]OOKUMA Y F,KIYOSHIMA T,KOBAYSHI I,et al.Multiple functional involvement of Thymosin beta-4 in tooth germdevelopment[J].Histochem Cell Biol,2013,139:335-370.

[7]CHOI B D,YUN S H,JEONG S J,et al.Expression of thymosin β4 in odontoblasts during mouse tooth development[J].Int J Mol Med,2012,29(5):841-847.

[8]王先遠(yuǎn),朱曉穎.胸腺素β4研究概況及展望[J].國外醫(yī)學(xué)(預(yù)防、診斷、治療用生物制品分冊(cè)),2002,25(3):126-129.

[9]王茗,張堯,謝向榮,等.畢富勇冬凌草甲素通過PI3K/AKT通路誘導(dǎo) MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2013,18(2):161-165.

[10]董光輝,羅璇,翟溯瀾,等.哌立福辛通過激活GSK31抑制雷帕霉素耐藥細(xì)胞的生長[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2011,16(4):389-393.

Effect of siRNA-mediated thymosin β4silence on proliferation in mesenchymal stem cell

XIE Hongmei1,MENG Xiangyu1,SUN Tianxia1,ZHANG Lixuan1,ZHAO Yu1,QU Yi1,2*

(1.Traditional Chinese Medicine and Biotechnology Research and Development Center,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China;2.Jilin Safety Monitoring Center for Food and Drug,Changchun 130033,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of siRNA-mediated thymosin β4(Thymosin β4,Tβ4) silence on proliferation in activated mesenchymal stem cell(mesenchymal stem cell,MSC) and discuss the possible mechanism.MethodsMSC cells were divided into 2 groups:negative control group and siRNA-Tβ4 transfection group.The siRNA-Tβ4 was transfected into MSC cells and cell proliferation was measured by MTT,Real-time PCR detection ILK,AKT and CyclinD1mRNA expression quantity change,Western blot detection AKT and P-AKT protein content changes.ResultsMSC proliferation was significantly inhibited in siRNA-Tβ4 transfection group(P<0.01);Expression of the ILK,CyclinD1 mRNA of MSC transfected with siRNA-Tβ4 is reduced,AKT quantity remains the same(P<0.01);The siRNA-Tβ4 transfection group no change in total AKT protein,P-AKT protein content decreased.ConclusionThe siRNA-mediated Tβ4 silence significantly inhibits MSC proliferation by up regulating the ILK,p-AKT and CyclinD1expression in MSC.

Keywords：RNA interference;Tβ4;mesenchymal stem cell;ILK/AKT signaling pathway

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.03.008

基金項(xiàng)目：吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20140622003JC)；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20130101142JC)。

作者簡介：謝紅梅(1989-)，女，碩士研究生，主要從事中藥學(xué)研究。

*通信作者：曲毅，女，博士，助理研究員，電話-(0431)86172331，電子信箱-quyi1229@163.com

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-6258(2016)03-0462-03

(收稿日期:2016-03-21)