針刺對(duì)腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)缺血半暗帶細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

許軍峰 張　浪，田　騫，郭士明，鄭亞玲，汪曉晴

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院博士后科研流動(dòng)站,北京 100700；3.子長(zhǎng)縣人民醫(yī)院，陜西 子長(zhǎng) 717300;4.天津市東麗區(qū)中醫(yī)院，天津 300300;5.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

針刺對(duì)腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)缺血半暗帶細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

許軍峰1,2張浪3，田騫1，郭士明4，鄭亞玲5，汪曉晴5

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院博士后科研流動(dòng)站,北京 100700；3.子長(zhǎng)縣人民醫(yī)院，陜西 子長(zhǎng) 717300;4.天津市東麗區(qū)中醫(yī)院，天津 300300;5.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

摘要：目的觀察腦缺血再灌注后,針刺對(duì)腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)缺血半暗帶細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。方法采用改良Longa氏線栓法制作局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，用多聚甲醛灌注，戊而醛固定，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后,HU-12A 型電鏡下觀察大鼠皮質(zhì)缺血半暗帶細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果模型組6 h神經(jīng)元輕度損傷，染色質(zhì)邊集凝固，血管周圍水腫，水腫滲出明顯，毛細(xì)血管管腔狹窄，腦組織散在水腫，腦細(xì)胞破壞；針刺組5 d后神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，血管通暢，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)損傷，腦組織無(wú)水腫、滲出、無(wú)壞死區(qū)域，新生毛細(xì)血管增多。結(jié)論針刺能夠減輕腦水腫，較少神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，促進(jìn)新生毛細(xì)血管的增生，從而達(dá)到保護(hù)腦組織的目的。

關(guān)鍵詞：針灸療法；腦缺血再灌注；細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

在世界范圍內(nèi)，腦卒中是死因排第二位的疾病，同時(shí)也是致殘的主要原因。隨著人口的老齡化[1]，腦梗死的發(fā)病率還在不斷地攀升。而缺血性卒中(腦梗死)約占腦卒中的80%[2-3]，目前被證明有效的藥物僅有溶栓藥和抗血小板劑[4]。溶栓治療是目前最有效的治療手段，但溶栓治療的適應(yīng)癥非常嚴(yán)格而且具有潛在的風(fēng)險(xiǎn)(如顱內(nèi)出血)導(dǎo)致僅有極少數(shù)病人能接受溶栓治療。針刺治療腦卒中療效顯著，本文將從腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)缺血半暗帶細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)方面研究針刺的作用。

1材料與方法

1.1動(dòng)物SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠46只，體質(zhì)量280～300g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2分組與取材選擇清潔級(jí)健康成年雄性的SD 大鼠36只，體質(zhì)量280～330 g，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組(即手術(shù)組)、假手術(shù)組和針刺組，每組12 只。手術(shù)組和針刺組按再灌注時(shí)間點(diǎn)和腦組織取材來(lái)源再分為：6 h缺血側(cè)(I 1)、6 h缺血對(duì)側(cè)(C 1)、5 d缺血側(cè)(I 2)、5 d缺血對(duì)側(cè)(C 2)4個(gè)亞組。I 1 和I 2在梗死灶邊緣區(qū)頂葉皮層取材，C 1和C 2則在大腦對(duì)側(cè)相應(yīng)皮層取材。相同再灌注時(shí)間點(diǎn)的缺血側(cè)與缺血對(duì)側(cè)的腦組織取材于同一大鼠，6 h和5 d各5 只。假手術(shù)組再分為6 h(S 1)和5 d(S 2)2個(gè)亞組，各5只，取材部位與I 1、I 2一致。

1.3大鼠腦缺血再灌注模型的建立參照改良Longa氏線栓法[5]制備右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型，在阻塞大腦中動(dòng)脈90 min 時(shí)將栓線拔出至頸外動(dòng)脈內(nèi)實(shí)現(xiàn)再灌注。大鼠清醒后出現(xiàn)左上肢癱瘓、轉(zhuǎn)圈、追尾征等為成功模型。假手術(shù)組不插入線栓，其余操作同手術(shù)組。術(shù)中及大鼠蘇醒過(guò)程肛溫保持在37 ℃。

1.4醒腦開竅取穴及針刺方法根據(jù)中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的“動(dòng)物針灸穴位圖譜”，選用人中、內(nèi)關(guān)、三陰交共3個(gè)穴位進(jìn)行針刺，非穴點(diǎn)取脅下固定點(diǎn)作為對(duì)照，針具用蘇州醫(yī)療用品廠生產(chǎn)的“華佗牌”毫針，長(zhǎng)1.5寸，直徑0.32 mm。先刺雙側(cè)內(nèi)關(guān)：直刺0.5～1寸，用捻轉(zhuǎn)提插結(jié)合瀉法，施手法1 min；繼刺人中：向鼻中隔方向斜刺0.3～0.5寸，用重雀啄法，施手法1 min；再刺三陰交：沿脛骨內(nèi)側(cè)緣與皮膚呈45°角斜刺，進(jìn)針1～1.5寸，用提插補(bǔ)法，使患側(cè)下肢抽動(dòng)3次為度。非穴點(diǎn)進(jìn)針0.5～1寸，施平補(bǔ)平瀉手法1 min。6 h組針刺1次，5 d組針刺3 d。

1.5主要試劑醋酸鈾和枸櫞酸鉛、樹脂、多聚甲醛、輸液瓶及輸液管、戊而醛、鋨酸、乙醇和環(huán)氧丙烷、醋酸鈾、環(huán)氧丙烷、EPON包埋液等。

1.6主要步驟麻醉行腦灌注固定,分離皮質(zhì)、海馬,固定、脫水、樹脂包埋、超薄切片、醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后,HU- 12A 型電鏡下觀察并攝片。1)灌注:麻醉后開胸，暴露充分些容易心臟穿刺及剪開右心耳。心尖插入灌注針頭，剪開右心耳，開放靜脈血。先灌注生理鹽水約100 mL，見(jiàn)到老鼠兩前肢及兩肺變白可改灌注多聚甲醛。灌注成功的標(biāo)志：剛開始灌注時(shí)老鼠前肢劇烈抽動(dòng)(下肢不抽動(dòng)證明腹主動(dòng)脈夾閉完全)，前肢及頸部僵硬，所灌注的腦組織白而硬。2)取腦:剪開皮膚暴露頭及頸段，從頸椎處剪斷頸髓，分離除去后頸部肌肉，用彎鉗仔細(xì)剔除顱骨，分離顱骨時(shí)注意硬腦膜，避免硬腦膜劃傷腦組織。取腦時(shí)可以從延髓開始，慢慢分離顱底組織。取腦缺血灶邊緣區(qū)皮質(zhì)組織1 m3，用6%的戊而醛固定劑2 h。3)切片：固定的組織以0.1 mol的PBS洗2遍，加入1%鋨酸固定1 h，以蒸餾水將標(biāo)本洗2遍，繼之以30%、70%、90%、100%乙醇和環(huán)氧丙烷各脫水10～15 min，用1∶1環(huán)氧丙烷和EPON包埋液的混合液浸透標(biāo)本2 h后加入包埋液浸透，將標(biāo)本挑入膠囊中放入烤箱(60 ℃，24 h)。用德國(guó)LKB8870超薄切片機(jī)切片，厚度 500 nm，醋酸鈾染液染10 min，鉛染液染8 min，用HU-12A電子顯微鏡觀察。

2結(jié)果

電鏡下可見(jiàn)腦皮質(zhì)缺血灶周圍皮質(zhì)部分假手術(shù)組6 h組神經(jīng)元膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，無(wú)炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，無(wú)水腫壞死，線粒體機(jī)構(gòu)正常；模型組6 h神經(jīng)元輕度損傷，染色質(zhì)邊集凝固，血管周圍水腫，水腫滲出明顯，毛細(xì)血管管腔狹窄，腦組織散在水腫，腦細(xì)胞破壞；針刺組6 h膠質(zhì)細(xì)胞輕度損傷，髓鞘退行性變，大部分毛細(xì)血管接近正常，偶見(jiàn)角質(zhì)細(xì)胞凋亡，大部分神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，少數(shù)水腫。假手術(shù)組5 d神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管、血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，腦組織無(wú)水腫或滲出；模型組5 d部分腦組織局灶性壞死，周圍水腫，血管內(nèi)皮損傷不明顯；針刺組5 d神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，血管通暢，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)損傷，腦組織無(wú)水腫、滲出、無(wú)壞死區(qū)域，新生毛細(xì)血管增多。

3小結(jié)

JIANG Bin[6]、楊文娟[7]指出我國(guó)的腦梗死及腦出血發(fā)病率高于西方國(guó)家，尤其是≥55歲的個(gè)體。MICHAEL HLEV等[8]研究表明，急性期應(yīng)予以溶栓治療為主，對(duì)于沒(méi)有溶栓使血管完全再通的患者，病灶具有進(jìn)一步擴(kuò)大的趨勢(shì)。HAROLD P[9]研、梁磊[10]究報(bào)告也指出目前治療方法主要包括動(dòng)脈內(nèi)溶栓，加強(qiáng)腦灌注，搭橋，抗血凝，抗血小板聚集率等對(duì)癥處理，但是這些改變血流變化的方案，會(huì)引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的并發(fā)癥，往往需要嚴(yán)密的臨床監(jiān)測(cè)，急性外科手術(shù)治療的安全性和有效性缺乏具體的數(shù)據(jù)支持。WU Bo等[11]對(duì)2004年前國(guó)家現(xiàn)用的中成藥治療中風(fēng)的作用做出了系統(tǒng)評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，無(wú)充分證據(jù)表明中成藥對(duì)此有很好的治療與預(yù)防效果，然因其無(wú)毒性和潛在的治療意義，仍值得進(jìn)一步研究。石磊等[12]研究表明電針干預(yù)可顯著提高M(jìn)CAO模型大鼠局部腦血流量，可同步提高梗死灶對(duì)側(cè)半球局部腦血流量，由此可增加梗死區(qū)周圍腦血流灌注。ZHANG Yannan等[13]研究表明針刺內(nèi)關(guān)穴可以改善大鼠的運(yùn)動(dòng)功能，能增加腦血流量，縮小梗死病灶，即使在臨床中細(xì)微改變肢體的運(yùn)動(dòng)功能也能較大程度改善患者的生活水平。本實(shí)驗(yàn)顯示，針刺能夠減輕腦水腫，較少神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，促進(jìn)新生毛細(xì)血管的增生，從而達(dá)到保護(hù)腦組織的目的。

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Acupuncture on ultrastructure of the cortical ischemia semi-dark cells of rats with cerebral ischemia and reperfusion

XU Junfeng1,2,ZHANG Lang3,TIAN Qian1,GUO Shiming4，ZHENG Yaling5，WANG Xiaoqing5

(1.First Teaching Hospital of Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China;2.The Chinese Academy of Sciences of Postdoctoral Scientific Research in TCM,Beijing 100700;3.Zichang People’s Hospital,Shaanxi Province,Zichang 717300,Shaanxi Province,China;4.Dongli District Hospital of TCM,Tianjin 300300,China;5.Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China;)

Abstract：ObjectiveTo observe the effects of acupuncture on penumbra ultrastructure of the cortical ischemia semi-dark cells of rats with cerebral ischemia and reperfusion.MethodsFocal cerebral ischemia reperfusion rat model was made by modified longa's thread embolism method with paraformaldehyde perfusion and fixed by e and aldehyde.After double staining with uranyl acetate and lead citrate,HU-12A electron microscope was used to observe the ultrastructural change of the cortical ischemia semi-dark cells of rats with cerebral ischemia and reperfusion.ResultsIn the model group,the 6 h neurons were mild damaged,with the peripheral blood coagulation,blood vessels surrounding edema with obvious exudation,capillary lumen stenosis,cerebral tissue edema,and cerebral cell destruction.However,in the acupuncture group,5D postsynaptic neurons structure kept normal with blood vessels smooth,no damage in capillary endothelial cells,no edema,exudation,nor necrosis in cerebral tissue,and the in crease of newly born blood capillary.ConclusionAcupuncture can relieve cerebral edema,the damage of neuron cells,and promote the proliferation of new blood capillary,so as to protect brain tissue.

Keywords：acupuncture therapy;cerebral ischemia and reperfusion;ultrastructure of cortex

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.03.006

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題項(xiàng)目“名老中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)學(xué)術(shù)思想傳承研究”(2013BA13B031)；天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院拓新工程課題(201202)。

作者簡(jiǎn)介：許軍峰(1974-)，女，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，主要從事針灸治療腦血管疾病及經(jīng)筋病的研究。

中圖分類號(hào)：R245.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-6258(2016)03-0455-03

(收稿日期:2015-09-10)