應(yīng)用宏基因組測(cè)序開展銀黑狐真菌皮膚病分子流行病調(diào)查

易立，曹智剛，仝明薇，程悅寧，程世鵬

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春130112)

皮膚真菌病是一種感染畜禽和人類的人獸共患病，它是一種淺表皮膚病，主要癥狀是患部斷毛、掉毛或出現(xiàn)圓形脫毛區(qū)，皮屑較多。該病是一種接觸性人獸共患病[1]，對(duì)毛皮動(dòng)物的皮張質(zhì)量造成了較大損害和經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也給養(yǎng)殖員帶來威脅[2]。

皮膚真菌病在我國不同地域的許多毛皮獸養(yǎng)殖場(戶)都有一定程度的流行，但不少養(yǎng)殖者對(duì)該病認(rèn)識(shí)不清，常誤認(rèn)為是疥螨引起，因而臨床上治療不得當(dāng)，造成較長時(shí)間的流行和傳染，甚至導(dǎo)致一部分感染獸死亡。隨著我國養(yǎng)狐業(yè)的發(fā)展壯大，近年來的養(yǎng)殖量已突破1000萬只，皮膚真菌病在疫病防控中顯得越來越重要[3]。因此，對(duì)養(yǎng)殖狐貉聚集地的吉林大安地區(qū)進(jìn)行了銀黑狐皮膚病取樣調(diào)查。銀黑狐皮膚病病變主要發(fā)生在動(dòng)物的背部、背腹部及四肢等處，形成近圓形的脫毛并形成癬斑，有的癬斑中央部開始痊愈長毛，而周圍繼續(xù)脫毛，呈現(xiàn)輪狀癬斑，嚴(yán)重者蔓延全身大部分軀體，病貂精神萎靡不振、食欲降低、逐漸消瘦、貧血、生長發(fā)育遲緩。

在目前的檢測(cè)體系中，真菌診斷仍然以傳統(tǒng)的培養(yǎng)鏡檢為主，然而培養(yǎng)過程相當(dāng)耗時(shí)，且時(shí)常遭遇無法培養(yǎng)的困難，因此，傳統(tǒng)鑒定無法滿足臨床快速正確診斷的需求。近年來，有許多非培養(yǎng)式鑒定方法被研究開發(fā)來改善病患的診療[4]，宏基因組即生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和，它以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象，以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的。宏基因組學(xué)技術(shù)第一次使人類得以研究占環(huán)境中99%的不可培養(yǎng)的微生物種群，從而成為微生物研究的最前沿領(lǐng)域。

本研究應(yīng)用宏基因組測(cè)序方式，對(duì)樣本中所有真菌樣本的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)進(jìn)行序列測(cè)定和生物學(xué)統(tǒng)計(jì)，尋找出銀黑狐真菌皮膚病致病性病原體以及研究其分子特征，為進(jìn)一步開發(fā)出皮膚真菌病快速診斷試劑奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　病料樣本

采自發(fā)病的銀黑狐皮膚，以外科刀刮取病變部鱗屑和皮膚，用安瓶收集，4℃保存，運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。

1.2　試劑

E.Z.N.A.Soil DNA Kit(OMEGA公司)；Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒(Life Technologies公司)；TaqDNA Polymerase(Thermo Fisher Scientific公司)；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司)。

1.3　樣本DNA的提取

使用磁珠法提取樣本中的DNA，Qubit2.0檢測(cè)DNA濃度，瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA完整性。

1.4　PCR擴(kuò)增

利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)應(yīng)加入的DNA量。PCR所用的引物已經(jīng)融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的ITS3-4通用引物：

ITS4引物：CCTACACGACGCTCTTCCGATCTNTCC TCCGCTTATTGATATGC；

TS-3-F引物：TGACTGGAGTTCCTTGGCACCC GAGAATTCCAGCATCGATGAAGAACGCAGC

以樣品中提取的總DNA為模版，擴(kuò)增16S rRNA V3-V4區(qū)基因。PCR采用20μL擴(kuò)增體系：5×FastPfu Buffer 4μL、2.5mM dNTPs 2μL、上游引物和下游引物各0.4μL、FastPfu Polymerase 0.4μL、Template DNA 10ng，加滅菌水補(bǔ)至20μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性2min；25個(gè)循環(huán)，95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 4s；72℃延伸10min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，采用QIA quickGelExtraction Kit回收純化目的條帶膠，將純化產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司，測(cè)序平臺(tái)為Illumina Miseq。

1.5　宏基因組測(cè)序分析

生物信息分析主要包括分類操作單元(OUT)的生成、取樣充足性分析、豐度和多樣性分析、菌群間差異分析、假設(shè)驗(yàn)證分析、進(jìn)化樹分析等。修剪、去除序列中可能含有的模糊堿基，可得到供準(zhǔn)確分析的優(yōu)化序列。設(shè)定具有97%以上相似性的序列為1個(gè)OTU，特定的1個(gè)分類操作單元代表某一特定物種。在門和屬2個(gè)分類水平上統(tǒng)計(jì)樣品的物種豐度和多樣性。

2　結(jié)果與分析

2.1　PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，在所有7個(gè)樣本中均檢測(cè)到了真菌目標(biāo)PCR產(chǎn)物。這表明基因組DNA質(zhì)量較好，可以滿足正常的16S rRNA基因擴(kuò)增，為后面的高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)提供基因組模板。

2.2　高通量測(cè)序數(shù)量

所有樣品均得到覆蓋深度極深的測(cè)序數(shù)據(jù)(表1)。在7個(gè)樣品中除去冗余后的序列數(shù)達(dá)到17 537條～51 028條。其中，F(xiàn)oxJL組代表狐貍樣本1～7。

表1高通量測(cè)序的數(shù)據(jù)量

Table 1 Datas of metagenomic sequencing

2.3　種分類水平下狐貍皮膚樣本真菌群結(jié)構(gòu)

在種分類水平進(jìn)行狐貍皮膚樣本真菌群結(jié)構(gòu)分析，這些菌群在分類學(xué)上歸屬于16個(gè)種，其中，有18%(3/16)的種在種水平下不能被鑒定和分類。對(duì)豐度≥0.01%的種進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，<0.01%的計(jì)入其他。在已分類的種中，其中有11個(gè)種的豐度占總體數(shù)量的99%，這11個(gè)種包括苯黑末節(jié)皮真菌(Arthrodermabenhamiae)、波蘭青霉菌(Penicilliumpolonicum)、分子孢子菌(Cladosporium)、紅酵母菌(Rhodotorulaglutinis)、新型隱球菌(Cryptococcusmagnus)、球孢銀耳菌(Tremellales)、出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)、Davidiellatassiana、耐鹽枝孢菌(Cladosporiumhalotolerans)、Candidarailenensis、莖點(diǎn)霉菌(Phomahuancayensis)、森林桑黃菌(Inonotussanghuang)、Cryptococcusadeliensis等。具體種分類水平分布見圖2。其中，苯黑末節(jié)皮真菌為致病菌，在樣品的測(cè)序頻率中最高可占90%。

圖2　基于OTU的菌群結(jié)構(gòu)分析

2.4　系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將本研究中的真菌序列和數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)序列一起，建立基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，本研究中所獲得的序列信息具有相當(dāng)程度的多樣性，主要分為3個(gè)大類，其中，苯黑末節(jié)皮真菌(Arthrodermabenhamiae)與發(fā)菌科(Trichocomaceae)拓?fù)浞诸悓W(xué)上接近，而發(fā)菌科為感染人皮膚的重要真菌，因此，本研究中狐貍表皮真菌極有可能是人獸共患性真菌。

3　討論

真菌感染在臨床上相當(dāng)常見，不僅會(huì)感染表皮質(zhì)層或附屬結(jié)構(gòu)，也會(huì)侵犯真皮、皮下組織，甚至是內(nèi)臟器官或血液等循環(huán)系統(tǒng)。目前的資料顯示，毛皮獸臨床上的真菌感染以犬小孢子菌和毛癬菌為主[5]。對(duì)于臨床上逐漸復(fù)雜且嚴(yán)重的真菌性感染，只有迅速而正確鑒定出感染菌種[6]才能采取有效的藥物治療[7]。

真菌是以DNA為遺傳物質(zhì)的真核生物，除細(xì)胞核之外，線粒體也具有DNA，真菌可存在單倍體或雙倍體，而且部分菌絲也缺乏細(xì)胞核，因此，真菌DNA的分離純化產(chǎn)量差異很大，也導(dǎo)致此方法在臨床鑒定上的困難。盡管如此，DNA在宿主被感染的組織中仍可穩(wěn)定存在并被分離。目前，可以從動(dòng)物全血、血清和糞便中純化出真菌DNA，但是最大的困擾在于缺乏標(biāo)準(zhǔn)有效的核酸提取手段[8，9]。宏基因組高通量測(cè)序作為第2代DNA測(cè)序技術(shù)，其敏感性大大提高。結(jié)合數(shù)據(jù)庫和生物信息學(xué)，能非常便捷地檢測(cè)和鑒定出真菌種類。

目前，已有多起人感染毛皮獸真菌引起皮膚病的報(bào)道[10，11]，但是至今為止，并未清楚其具體病原體。本研究應(yīng)用高通量測(cè)序，首次鑒定出大安銀黑狐皮膚真菌病的病原體。在實(shí)驗(yàn)過程中，宏基因組測(cè)序作為強(qiáng)有力地研究手段，顯示出巨大地應(yīng)用潛力，能檢測(cè)出樣本中幾乎所有的微生物。

[1]王衛(wèi)青,劉鵬.毛皮動(dòng)物常見皮膚病及其防治措施[J].湖北畜牧獸醫(yī),2014,(2):38-39.

[2]張勇,董麗華,吳長強(qiáng).毛皮動(dòng)物的掉毛和脫毛原因及綜合防治[J].山東畜牧獸醫(yī),2012,(5):84-85.

[3]范治斌,董海燕,尚學(xué)東,等.遼寧省當(dāng)前毛皮動(dòng)物疫病流行狀況及對(duì)策[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2014,(10):46-48.

[4]張卓,梁新江,李蓓,等.特種毛皮動(dòng)物真菌性皮膚病主要的診斷技術(shù)[J].飼料博覽,2016,(2):54.

[5]錢靖.犬小孢子菌生物學(xué)性狀及基因分型研究[D].蘭州:蘭州大學(xué),2008.

[6]蔣國琴.毛皮動(dòng)物癬病、螨病、濕疹的鑒別診斷和治療[J].畜牧市場,2007,(8):52.

[7]吳云飛.鹽酸特比萘芬的安全性和抗真菌藥物的敏感性及臨床療效試驗(yàn)[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[8]孫姝,于闖,劉麗瓊,等.寵物犬貓常見皮膚病及防治[J].吉林畜牧獸醫(yī),2014,(4):50-51.

[9]陳一.泰州地區(qū)犬常見皮膚病流行病學(xué)調(diào)查及防控對(duì)策[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2014.

[10]趙靖波.當(dāng)心毛皮動(dòng)物的皮膚真菌病傳染給人[J].特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物,2006,(5):46.

[11]侯志軍,張智杰,劉偉石,等.毛皮動(dòng)物飼養(yǎng)場飼養(yǎng)員感染貉源真菌病一例[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2010,20(10):61.