不同濃度CCl4注射聯(lián)合飲用乙醇誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型研究

翟偉，刁廣浩，李瑞生，張紹庚，王兆海

·短篇論著·

不同濃度CCl4注射聯(lián)合飲用乙醇誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型研究

翟偉，刁廣浩，李瑞生，張紹庚，王兆海

目的探索不同濃度CCl4聯(lián)合飲用乙醇制備大鼠肝硬化模型，尋求最佳的藥物和乙醇濃度。方法取90只SD大鼠,分為對(duì)照組10只和實(shí)驗(yàn)組A組、B組、C組和D組，每組20只，給予不同濃度的CCl4油溶液腹腔注射，同時(shí)以不同濃度的乙醇溶液為飲用水，制備肝硬化模型。結(jié)果在實(shí)驗(yàn)12 w末，A組大鼠死亡10只,B組死亡8只,C組死亡4只，D組死亡5只；實(shí)驗(yàn)A組肝細(xì)胞走向紊亂，纖維組織增生，纖維間隔形成。有假小葉形成，肝細(xì)胞大小不一，呈點(diǎn)灶狀壞死，肝細(xì)胞凋亡、再生，匯管區(qū)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；B組與A組變化相似；C組肝細(xì)胞走向紊亂，纖維間隔形成，但無(wú)假小葉形成，肝細(xì)胞脂肪變性，纖維組織增生，肝細(xì)胞凋亡，匯管區(qū)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；D組與C組表現(xiàn)類似。結(jié)論適當(dāng)濃度的CCl4油溶液結(jié)合乙醇溶液為飲用水誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型可顯著提高造模成功率。

肝硬化；四氯化碳；乙醇；大鼠

建立理想的肝硬化動(dòng)物模型不僅是進(jìn)行肝病實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)，也是臨床評(píng)價(jià)肝硬化診斷和治療方法的有效手段之一［1-6］。本實(shí)驗(yàn)采用皮下注射CCl4油溶液結(jié)合飲用乙醇制作肝硬化大鼠模型，觀察了肝組織結(jié)構(gòu)的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與藥品3～4周齡健康雄性SD大鼠90只,體質(zhì)量100～150 g,由我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，采取人工光照，明、暗各12 h，溫度24～26℃，濕度50%～60%，噪音＜50db，每個(gè)鼠籠放置少于4只大鼠。對(duì)大鼠的處置按照中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，全程符合動(dòng)物倫理學(xué)管理要求。四氯化碳（分析純）由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供；市售某品牌中性菜籽食用油；苯巴比妥鈉（0.1 g/1 m l）由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供；3%戊巴比妥鈉溶液由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供；市場(chǎng)銷售的某品牌飲用白酒（乙醇含量為60%）。

1.2 肝硬化模型的制備將動(dòng)物分為實(shí)驗(yàn)組80只和對(duì)照組10只。給予實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物每升蒸餾水中含0.35 g苯巴比妥鈉的溶液代替飲用水飲用2 w。將實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物分為4組，每組20只。給予A組動(dòng)物50%四氯化碳中性菜籽油溶液0.5 ml/100 g體質(zhì)量腹腔注射,2次/w,并以10%乙醇溶液為其惟一飲用水，持續(xù)12 w；給予B組動(dòng)物四氯化碳中性菜籽油溶液同A組,但以蒸餾水為其惟一飲用水；給予C組33%四氯化碳中性菜籽油溶液0.5 m l/100 g體質(zhì)量腹腔注射,2次/w,以10%乙醇溶液為其惟一飲用水，持續(xù)12 w；給予D組四氯化碳中性菜籽油溶液同C組,以20%乙醇溶液為其惟一飲用水；給予對(duì)照組普通顆粒飼料喂養(yǎng)，正常飲蒸餾水。在實(shí)驗(yàn)第12 w末，處死大鼠,開(kāi)腹，取肝組織行石蠟包埋、切片、HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 病死率對(duì)照組大鼠無(wú)死亡；在誘導(dǎo)12周過(guò)程中，20只A組大鼠死亡10只（50%）；20只B組大鼠死亡8只（40%）；20只C組大鼠死亡4只（20%）；20只D組大鼠死亡5只（25%）。

2.2 組織病理學(xué)表現(xiàn)對(duì)照組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝板條索狀以中央靜脈為中心呈放射狀排列，無(wú)肝細(xì)胞變性、壞死（圖1）；實(shí)驗(yàn)A組肝細(xì)胞走向紊亂，纖維組織增生，纖維間隔形成。有假小葉形成，肝細(xì)胞大小不一，呈點(diǎn)灶狀壞死，肝細(xì)胞凋亡、再生，匯管區(qū)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2、圖3）；B組與A組變化相似；C組肝細(xì)胞走向紊亂，纖維間隔形成，但無(wú)假小葉形成，肝細(xì)胞脂肪變性，纖維組織增生，肝細(xì)胞凋亡，匯管區(qū)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；D組與C組表現(xiàn)類似（圖4、圖5）。

3 討論

肝硬化動(dòng)物模型的制作方法包括血吸蟲(chóng)尾蚴法[7]、四氯化碳法[8]、硫代乙酰胺法[9]、低劑量長(zhǎng)期應(yīng)用致癌物法[10]、膽總管結(jié)扎法[11]和乙醇性[12]肝硬化模型等。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腹腔注射不同濃度的CCl4，結(jié)合飲用乙醇制備大鼠肝硬化模型，出現(xiàn)明顯的肝細(xì)胞點(diǎn)、灶狀壞死及纖維性變，肝細(xì)胞走向紊亂，纖維組織增生，纖維間隔形成，假小葉形成，肝細(xì)胞大小不一，呈點(diǎn)灶狀壞死，肝細(xì)胞凋亡、再生，匯管區(qū)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，提示肝硬化病變制備成功。肝纖維化是肝臟進(jìn)一步向肝硬化發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，其主要表現(xiàn)在肝內(nèi)纖維組織增生和纖維間隔形成，它是對(duì)各種原因所致肝損傷的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，同時(shí)也是慢性肝病的重要病理特征。

圖1 對(duì)照組大鼠肝組織學(xué)表現(xiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞無(wú)變性、壞死（HE，10×）

圖2 實(shí)驗(yàn)A組大鼠肝組織學(xué)表現(xiàn)肝細(xì)胞走向紊亂，纖維間隔形成，有假小葉形成（（HE，10×）

圖3 實(shí)驗(yàn)A組大鼠肝組織學(xué)表現(xiàn)肝細(xì)胞走向紊亂，纖維間隔形成，伴假小葉形成（HE，20×）

圖4 實(shí)驗(yàn)C組大鼠肝組織學(xué)表現(xiàn)肝細(xì)胞走向紊亂，細(xì)胞變性、壞死，纖維間隔形成，成熟假小葉形成（HE，10×）

圖5 實(shí)驗(yàn)C組大鼠肝組織學(xué)表現(xiàn)肝細(xì)胞走向紊亂，細(xì)胞變性、壞死，纖維間隔形成，成熟假小葉形成（HE，20×）

四氯化碳是使用最早、最廣泛的肝纖維化誘導(dǎo)劑[11]。四氯化碳誘導(dǎo)慢性肝損傷的機(jī)理是直接損害肝細(xì)胞,破壞細(xì)胞的各種成分,造成肝細(xì)胞的脂肪變性和壞死。乙醇為酶誘導(dǎo)劑,損害線粒體,增加肝細(xì)胞氧耗量,還可增強(qiáng)四氯化碳對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用,兩者同時(shí)作用可促進(jìn)肝硬化的形成[12]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)四氯化碳的濃度及飲用乙醇溶液濃度進(jìn)行了改進(jìn)，探討了最合適的四氯化碳濃度誘導(dǎo)肝硬化大鼠模型，同時(shí)以不同濃度的乙醇溶液為飲用水，持續(xù)12周，觀察大鼠肝硬化模型制備的成功率及動(dòng)物死亡率。實(shí)驗(yàn)證明,適當(dāng)濃度的四氯化碳油溶液能顯著增加肝硬化模型的成功率，而對(duì)大鼠的死亡率無(wú)明顯影響，同時(shí)適當(dāng)濃度的乙醇溶液可以加快大鼠的適應(yīng)期，減少大鼠拒飲現(xiàn)象，更好地誘導(dǎo)肝硬化模型，而高濃度的四氯化碳直接注射可以導(dǎo)致部分大鼠出現(xiàn)急性肝功能衰竭而死亡,而稍高濃度的乙醇溶液對(duì)大鼠的肝硬化成模無(wú)明顯影響，且部分大鼠拒絕飲用高濃度乙醇亦可導(dǎo)致死亡[13]，適當(dāng)濃度的四氯化碳和乙醇可以維持對(duì)肝細(xì)胞的損害強(qiáng)度,因脂肪氧化減少,肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積,肝細(xì)胞破壞,假小葉形成,造成肝硬化的形成。本實(shí)驗(yàn)成功地制備了大鼠肝硬化模型,為以后研究肝硬化打下了基礎(chǔ)。

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（收稿：2016-05-06）

（本文編輯：陳宗炳）

A lcohol and CCl4-induced liver cirrhosis in rats

Zhai Wei,Diao Guanghao,Li Ruisheng,et al.
Department of Hepatobiliary Surgery,302nd Hospital,Beijing 100071

Liver cirrhosis;Alcohol;CCl4;Rats

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.06.018

100071北京市解放軍第302醫(yī)院肝膽外科一中心

翟偉，男，28歲，碩士研究生，住院醫(yī)師。主要從事肝膽外科診斷與治療學(xué)研究。E-mail:624229727@qq.com

王兆海，E-mail:pla302wzh@163.com