銅暴露對(duì)草魚幼魚代謝行為的影響

袁　喜，黃應(yīng)平，靖錦杰，蔣　清，胥　燾，涂志英，李為民（1.三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部工程研究中心（三峽大學(xué)），湖北宜昌443002；2.三峽地區(qū)地質(zhì)災(zāi)害與生態(tài)環(huán)境湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心（三峽大學(xué)），湖北宜昌443002；3.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，武漢430072）

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銅暴露對(duì)草魚幼魚代謝行為的影響

袁喜1，2，3，黃應(yīng)平1，2*，靖錦杰1，2，蔣清1，2，胥燾1，2，涂志英1，2，李為民1，2
（1.三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部工程研究中心（三峽大學(xué)），湖北宜昌443002；2.三峽地區(qū)地質(zhì)災(zāi)害與生態(tài)環(huán)境湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心（三峽大學(xué)），湖北宜昌443002；3.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，武漢430072）

摘要：為了探討水體中銅污染對(duì)魚的生態(tài)毒理效應(yīng)和游泳能力的影響，在實(shí)驗(yàn)室條件下，測(cè)定了銅暴露草魚（Ctenopharyngodon idella）幼魚半致死濃度、不同濃度銅暴露（0、0.025、0.050、0.075、0.10 mg·L-1）96 h后組織（肝、鰓、肌肉）銅累積量、相對(duì)臨界游泳速度（Ucrit）以及耗氧率（MO2）。結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，銅暴露對(duì)組織（肝、鰓、肌肉）銅累積量無(wú)顯著影響（P＞0.05），銅對(duì)草魚幼魚的安全濃度為0.008 mg·L-1。銅暴露草魚幼魚相對(duì)臨界游泳速度受抑制顯著（P＜0.05），不同濃度暴露后Ucrit分別較對(duì)照組下降了18.4%、21.8%、33.8%和38.1%。隨著游泳速度的增加，其速度-代謝率關(guān)系為MO2=a+b×Uc，隨著暴露濃度增加，速度參數(shù)c值增加，不同濃度銅暴露后c分別比對(duì)照組增加了37.78%、33.33%、56.67%和61.11%，表明游泳能量利用率下降。銅暴露導(dǎo)致草魚幼魚有氧代謝范圍增加，0.1 mg Cu·L-1時(shí)有氧代謝范圍比對(duì)照組增加了37.48%。銅暴露對(duì)草魚幼魚的游泳能力以及氧代謝行為產(chǎn)生影響，尤其是導(dǎo)致游泳效率降低、抑制游泳能力。

關(guān)鍵詞：草魚；銅；游泳能力；耗氧率

袁喜，黃應(yīng)平，靖錦杰,等.銅暴露對(duì)草魚幼魚代謝行為的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 35（2）：261-265.

銅類殺菌藥物及肥料的使用造成養(yǎng)殖水體重金屬銅污染，并通過(guò)生物富集和生物放大效應(yīng)對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生重要影響，特別是對(duì)魚類等水生生物有較強(qiáng)的毒性[1-2]。作為水生生物食物鏈的頂層類群，魚體內(nèi)污染物水平和魚對(duì)污染物產(chǎn)生的生物效應(yīng)可客觀反映水環(huán)境的狀況。研究表明長(zhǎng)江沉積物中重金屬銅的富集系數(shù)較高[3]，關(guān)于重金屬銅在草魚（Ctenopharyngodon idella）組織中的積累與分布和毒性效應(yīng)的研究文獻(xiàn)報(bào)道較多，銅對(duì)草魚存活率和生長(zhǎng)[4]、體內(nèi)酶活性、抗氧化功能、遺傳物質(zhì)[5]等方面的影響已有相關(guān)研究。但目前關(guān)于銅暴露導(dǎo)致草魚幼魚代謝及行為變化的研究尚鮮見報(bào)道。

魚類生理生態(tài)行為對(duì)環(huán)境因子變化的適應(yīng)性最先表現(xiàn)為行為上的改變[6]，臨界游泳速度（Ucrit）在某種程度上反映了動(dòng)物的有氧運(yùn)動(dòng)能力，代謝率范圍（Metabolicraterange）用于評(píng)價(jià)魚類的有氧代謝能力[7-8]。本文通過(guò)研究不同濃度水體銅暴露對(duì)草魚幼魚游泳能力與代謝范圍以及組織（鰓、肝、肌肉）銅累積量的影響，考察其幼魚因水體銅濃度變化而引發(fā)的運(yùn)動(dòng)和代謝方面的改變，從而評(píng)估銅污染對(duì)草魚幼魚潛在的生態(tài)毒性，為水生態(tài)毒理學(xué)基礎(chǔ)研究提供參考，對(duì)水體重金屬污染、水產(chǎn)品養(yǎng)殖及環(huán)境治理決策具有實(shí)際意義。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用草魚幼魚于2015年1月購(gòu)于宜昌養(yǎng)殖場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)前將魚在實(shí)驗(yàn)室魚缸（420 L）中馴化2周。每2 d投喂飼料1次，飼料成分：蛋白質(zhì)＞38%，脂肪＞5%，纖維素＜5%，灰分＜12%，濕度＜11%。馴養(yǎng)用水為曝氣后的自來(lái)水，馴養(yǎng)期間充氣使水體溶氧水平接近飽和，日換水量約為水體的1/3，自然水溫（15±1）℃，自然光照。在實(shí)驗(yàn)前48 h停止喂餌料。

馴養(yǎng)結(jié)束后，選取健康幼魚60尾，隨機(jī)平均分配至各濃度梯度組，實(shí)驗(yàn)魚體長(zhǎng)、體重參數(shù)如表1。根據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，本研究共設(shè)5個(gè)銅（Cu2+）濃度梯度，分別為0、0.025、0.050、0.075、0.10 mg·L-1，暴露時(shí)間為96 h。暴露期間不投餌，每日定時(shí)換水并補(bǔ)充相應(yīng)濃度的硫酸銅溶液以保持水體銅濃度基本恒定，實(shí)驗(yàn)條件與馴養(yǎng)期間保持一致。

表1　草魚幼魚的體長(zhǎng)、體重參數(shù)（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Table 1 Body length and weight parameters of juvenile grass carp（mean±SD）

1.2實(shí)驗(yàn)方法

采用魚類游泳能力測(cè)定裝置[9]測(cè)定草魚Ucrit。將每個(gè)處理實(shí)驗(yàn)魚在暴露96 h后轉(zhuǎn)入游泳能力測(cè)定裝置中馴化2 h（流速為0.1 m·s-1）。適應(yīng)結(jié)束后，采用逐步遞增法，直至實(shí)驗(yàn)魚運(yùn)動(dòng)疲勞，其判定標(biāo)準(zhǔn)為：實(shí)驗(yàn)魚被水流沖到游泳區(qū)后面篩網(wǎng)上貼網(wǎng)不能游泳，則視為疲勞[9]。Ucrit計(jì)算公式：

式中：Ucrit為臨界游泳速度，BL·s-1；U1為實(shí)驗(yàn)魚所能完成的最大游泳速度（實(shí)驗(yàn)魚疲勞前的速度），BL·s-1；U2為速度增量，BL·s-1；T1為在最大游泳速度下未能完成設(shè)定歷時(shí)的實(shí)際持續(xù)時(shí)間，min；T2為設(shè)定時(shí)間步長(zhǎng)，min。

實(shí)驗(yàn)中時(shí)間步長(zhǎng)T2=30min，流速增量U2=1 BL·s-1。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每間隔5 min測(cè)定一次水中溶解氧含量，利用充氧泵進(jìn)行內(nèi)外水槽水的交換，使密封水槽溶解氧量不低于飽和溶解氧濃度的75%。游泳運(yùn)動(dòng)代謝率的計(jì)算公式：

式中：MO2為標(biāo)準(zhǔn)體重的運(yùn)動(dòng)代謝率，mg O2·h-1· kg-1；Sf為實(shí)驗(yàn)魚游泳時(shí)溶氧值隨時(shí)間變化斜率的絕對(duì)值（表觀耗氧量）；S0是無(wú)實(shí)驗(yàn)魚存在的溶氧值隨時(shí)間變化斜率的絕對(duì)值（細(xì)菌耗氧量）；60為時(shí)間常數(shù)，min·h-1；V是實(shí)驗(yàn)水體系統(tǒng)總體積，L；m為魚體重，kg。

代謝范圍為最大耗氧代謝率與最小耗氧率的差值。

魚體組織Cu2+含量測(cè)定：將草魚幼魚用丁香酚溶液麻醉后，解剖分離出鰓、肝臟、肌肉組織并于-40℃保存。將各組織樣本（以相同處理下12尾魚組織為一個(gè)樣本，分3組，對(duì)照組6尾魚）稱取2 g（濕重）并置于50 mL聚四氟乙烯消解罐中，加入4 mL HNO3（65%）過(guò)夜，然后加入2 mL HClO4（70%），電熱板上150℃加熱，蒸發(fā)至近干，冷卻后加適量0.1% HNO3，轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶，0.1%HNO3定容。采用SPEC TRA-240FS-石墨爐火焰型原子吸收分光光度計(jì)（Varian，美國(guó)）測(cè)定組織銅含量。利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)法校準(zhǔn)（DORM-2 National Research Council，Canada），回收率97.9%～108.3%。組織中重金屬含量用mg·kg-1（濕重，平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）表示。

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA，Duncan post hoc test）并檢驗(yàn)差異顯著性。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±S.E），顯著性水平為P＜0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1草魚幼魚鰓、肝臟、肌肉組織銅累積量特征

采用靜水急性毒性試驗(yàn)法測(cè)定銅對(duì)草魚幼魚的毒性，統(tǒng)計(jì)銅污染暴露24、48、72、96 h后草魚幼魚死亡率，直線內(nèi)插法計(jì)算獲得LC50分別為0.12、0.094、0.093、0.078 mg·L-1，根據(jù)96 h LC50×0.1計(jì)算安全濃度為0.008 mg·L-1。急性銅暴露下草魚幼魚鰓（F=2.04；P=0.16）、肝臟（F=1.99；P=0.17）和肌肉（F=1.99；P= 0.17）組織中銅累積量各處理間差異不顯著。銅暴露后幼魚組織中Cu2+的累積量如圖1所示。

圖1　銅暴露后草魚幼魚鰓、肝臟、肌肉組織銅累積量Figure 1 Gill，liver and muscle copper contents in juvenile grasscarp after exposed to different copper concentrations

2.2銅暴露對(duì)草魚幼魚臨界游泳速度的影響

銅暴露對(duì)草魚幼魚臨界游泳速度的影響顯著（F=36.21，P＜0.001），如圖2所示。隨著銅濃度增加，草魚幼魚相對(duì)臨界游泳速度逐漸下降，當(dāng)銅濃度為0.075～0.10 mg·L-1時(shí)，草魚幼魚相對(duì)臨界游泳速度顯著降低（P＜0.05）。對(duì)照組相對(duì)臨界游泳速度為（6.83± 0.24）BL·s-1，0.025、0.050、0.075、0.10 mg·L-1暴露組分別為（5.58±0.19）、（5.34±0.18）、（4.53±0.11）、（4.23± 0.05）BL·s-1，為對(duì)照組的81.61%、78.19%、66.24%和61.90%。

2.3銅暴露對(duì)草魚幼魚耗氧率及活動(dòng)代謝的影響

圖2　銅暴露對(duì)草魚幼魚相對(duì)臨界游泳速度的影響Figure 2 Effect of copper exposure on Ucritin juvenile grass carp

圖3　銅暴露對(duì)草魚幼魚代謝率（a）及活動(dòng)代謝（b）范圍的影響Figure 3 Effect of copper exposure on metabolic rate（a）and metabolic rate range（b）of juvenile grass carp

表2　不同銅暴露處理下草魚幼魚游泳速度與代謝率關(guān)系Table 2 Relationship between swimming speed and oxygen metabolic rate under different concentrations of copper exposed

圖3a顯示，隨著游泳速度的增大（1～4 BL·s-1），草魚耗氧代謝率呈增加趨勢(shì)。游泳速度與草魚幼魚代謝率可以用指數(shù)關(guān)系MO2=a+b×Uc表示（a、b、c為相關(guān)參數(shù)），其結(jié)果見表2。隨著暴露濃度增加，速度參數(shù)c值增加，不同濃度銅暴露使c分別比對(duì)照組增加了37.78%、33.33%、56.67%和61.11%。圖3b顯示，銅暴露對(duì)草魚幼魚有氧代謝范圍影響顯著（F=7.19，P= 0.005），隨著暴露濃度增加，有氧代謝范圍增大，濃度為0.10 mg·L-1時(shí)有氧代謝范圍比對(duì)照組增加了37.48%。

3　討論

在評(píng)價(jià)重金屬污染安全時(shí)，污染物毒性以及污染物對(duì)魚類行為影響的量化很重要，但是由于不同區(qū)系生物受生活環(huán)境等因素的影響，如不同物種對(duì)銅的耐受性和敏感度存在很大的差異[10]。如銅對(duì)廣東魴幼魚（Megalobramaterminalis）安全濃度為0.01 mg·L-1[11]，而對(duì)中華鱘（Acipenser sinensis Gray）幼魚的安全濃度為0.002 mg·L-1[12]，遠(yuǎn)低于中國(guó)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（銅的最高容許質(zhì)量濃度為0.01 mg·L-1）。本研究中Cu2+對(duì)草魚幼魚安全濃度為0.008 mg·L-1，根據(jù)有毒物質(zhì)對(duì)魚類的毒性標(biāo)準(zhǔn)[13]，可判斷Cu2+對(duì)草魚幼魚具有高毒性。鰓是魚類呼吸濾食的主要器官，直接暴露在重金屬環(huán)境中，因而對(duì)重金屬的積累較大；肝臟是金屬硫蛋白合成的主要場(chǎng)所，肝臟等組織中重金屬積累明顯；相對(duì)其他組織器官而言，肌肉代謝較慢，而且沒有直接暴露于重金屬。因此，魚類對(duì)重金屬的累積量為肝臟＞鰓＞肌肉[14-15]。銅暴露導(dǎo)致鰓和肝臟組織銅硫蛋白絡(luò)合物（Cu-MT）的含量明顯增加，加速了Cu2+在魚體內(nèi)的代謝進(jìn)程，多余的Cu2+結(jié)合蛋白進(jìn)入血液循環(huán)，并排泄到體外[16]。因此急性銅暴露后，魚體肝臟、鰓和肌肉組織重金屬累積量無(wú)顯著差異。

魚類呼吸系統(tǒng)的變化能迅速反映出機(jī)體自身機(jī)能的變化，它們對(duì)外環(huán)境變化敏感，是反映機(jī)體機(jī)能狀態(tài)的重要指標(biāo)。代謝率和代謝范圍的測(cè)定能在一定程度上反映魚類有氧運(yùn)動(dòng)的能力，對(duì)魚類行為測(cè)定具有重要的意義[17-18]。隨著暴露濃度增加，草魚幼魚呼吸代謝作用增強(qiáng)，有氧代謝范圍顯著增加（F=7.19，P＜0.01）。Cu2+等重金屬產(chǎn)生毒性效應(yīng)的途徑之一是誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生[19]。在正常生理狀態(tài)下，魚類抗氧化系統(tǒng)能夠清除機(jī)體代謝所產(chǎn)生的活性氧；在其暴露于一定濃度污染物時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生，導(dǎo)致相關(guān)抗氧化酶活性發(fā)生變化，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷[20]。低濃度Cu2+能夠誘導(dǎo)鰓組織補(bǔ)償（細(xì)胞增生、黏液分泌）反應(yīng)[21]，阻礙Cu2+的進(jìn)入，降低鰓損害程度[22]，而且銅暴露會(huì)刺激鰓膜以及口腔上皮，導(dǎo)致魚大量更頻繁地移動(dòng)，使耗氧率增加[23]。本研究與其相似，低濃度銅暴露誘導(dǎo)產(chǎn)生補(bǔ)償性反應(yīng)，草魚幼魚呼吸代謝作用增強(qiáng)。耗氧率和游泳速度呈冪函數(shù)關(guān)系MO2=a+b×Uc，其中反映游泳效率的速度常數(shù)c值越大游泳效率越低[9]。實(shí)驗(yàn)中c值變化趨勢(shì)隨著暴露濃度的增加而上升，即銅暴露導(dǎo)致游泳效率下降。

研究表明，外源化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)所產(chǎn)生的解毒作用引起魚類代謝水平升高，能量大量消耗導(dǎo)致活動(dòng)能力降低[24-25]。重金屬銅暴露使草魚幼魚能量的過(guò)量消耗，導(dǎo)致游泳能力的降低，不同濃度Cu2+暴露后Ucrit分別較對(duì)照組下降了18.4%、21.8%、33.8%和38.1%。另外，研究表明重金屬暴露可能導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超負(fù)荷[26]，甚至造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)損傷[27]，影響神經(jīng)細(xì)胞功能活動(dòng)，阻礙了神經(jīng)-肌肉突出的神經(jīng)傳導(dǎo)[28]，影響肌肉收縮。因此，Cu2+暴露導(dǎo)致草魚幼魚臨界游泳速度降低，也可能是神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的。環(huán)境脅迫產(chǎn)生的應(yīng)激行為反應(yīng)機(jī)理十分復(fù)雜，涉及神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)的一系列活動(dòng)，而且環(huán)境因素和重金屬之間的相互作用對(duì)不同年齡魚類運(yùn)動(dòng)和代謝行為影響的研究，在實(shí)際應(yīng)用中具有更重要的生產(chǎn)實(shí)踐意義，有待進(jìn)一步的研究。

4　結(jié)論

（1）Cu2+對(duì)草魚幼魚具有較高毒性，安全濃度為0.008 mg·L-1，草魚幼魚對(duì)Cu2+反應(yīng)靈敏。急性銅暴露草魚肝臟、鰓和肌肉組織銅累積量無(wú)顯著差異。

（2）低濃度Cu2+暴露誘導(dǎo)刺激鰓膜以及口腔上皮產(chǎn)生應(yīng)激性反應(yīng)，導(dǎo)致草魚幼魚大量更頻繁地運(yùn)動(dòng)，呼吸代謝作用增強(qiáng)，能量過(guò)量消耗，游泳效率下降，游泳能力降低。

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Effect of copper exposure on metabolism behavior of juvenile grass carp（Ctenopharyngodon idella）

YUAN Xi1,2,3, HUANG Ying-ping1,2*, JING Jin-jie1,2, JIANG Qing1,2, XU Tao1,2, TU Zhi-ying1,2, LI Wei-min1,2
（1. Innovation Center for Geo-Hazards and Eco-Environment in Three Gorges Area, China Three Gorges University, Yichang 443002, China；2.Engineering Research Center of Eco-Environment in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, China Three Gorges University, Yichang 443002, China；3.Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China）

Abstract：In this investigation, the eco-toxicological effects of copper on the swimming capability of juvenile grass carp（Ctenopharyngodon idella）were measured. Copper concentrations were measured in the gill, liver and muscle tissues of juvenile grass carp after a 96 h exposure to a range of copper concentrations; 0, 0.025, 0.050, 0.075 mg·L-1and 0.10 mg·L-1. Relative critical swimming speed（Ucrit）and metabolic rate（MO2）range were also measured after exposure. While the exposure did not significantly affect tissue concentrations（P＞0.05）, it did significantly affect Ucritand MO2range（P＜0.05）. The safe concentration for juvenile grass carp was 0.008 mg Cu·L-1. Compared to the control group, Ucritdecreased by 18.4%, 21.8%, 33.8% and 38.1% after 96 h exposure to 0.025, 0.05, 0.075 mg Cu·L-1and 0.10 mg Cu·L-1, respectively. The oxygen consumption rate increased exponentially with swimming speed; MO2=a+b×Uc. The speed parameter, c, increased with copper concentration by 37.78%, 33.33%, 56.67% and 61.11%, indicating a decrease in swimming efficiency. MO2range increased by 37.48% after exposure to 0.10 mg Cu·L-1copper. Exposure to copper polluted environment significantly affects the metabolism and swimming performance of juvenile grass carp, especially resulted in the decrease of swimming efficiency, inhibited swimming ability.

Keywords：Ctenopharyngodon idella; copper; swimming performance; oxygen consumption rate

*通信作者：黃應(yīng)平E-mail：chem_ctgu@126.com

作者簡(jiǎn)介：袁喜（1987—），男，湖北仙桃人，博士研究生，主要從事水污染控制及水生態(tài)研究。E-mail: chem_ctgu@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（51309140）；國(guó)家水專項(xiàng)（2012ZX07104-003-04）；湖北省創(chuàng)新群體項(xiàng)目（2015CFA021）

收稿日期：2015-09-26

中圖分類號(hào)：X503.225

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-2043（2016）02-0261-05

doi:10.11654/jaes.2016.02.008