OsPT6基因過表達(dá)對低磷條件下菜用大豆結(jié)瘤及固氮的影響

劉　偉,楊立飛,朱文莉,劉丹丹,朱月林

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,南京 210095)

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OsPT6基因過表達(dá)對低磷條件下菜用大豆結(jié)瘤及固氮的影響

劉偉,楊立飛,朱文莉,劉丹丹,朱月林*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,南京 210095)

摘要:采用砂培方法,以轉(zhuǎn)OsPT6基因的菜用大豆(T3株系)與其非轉(zhuǎn)基因(NT)受體品種為實驗材料,研究了兩者在低磷條件下的生長發(fā)育指標(biāo),植株有效磷、全磷、全氮、豆血紅蛋白和籽粒蛋白質(zhì)含量以及谷氨酰胺合成酶活性的差異,并對植株結(jié)瘤及固氮相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行檢測,為闡明轉(zhuǎn)OsPT6基因菜用大豆在低磷條件下結(jié)瘤及固氮相關(guān)機(jī)理提供理論依據(jù)。結(jié)果顯示:(1) 轉(zhuǎn)基因植株的株高、莖粗、花數(shù)和莢數(shù)、根瘤數(shù)均顯著高于NT 植株。(2)轉(zhuǎn)基因植株根、莖、葉及根瘤中有效磷,全株總磷、總氮含量,根瘤中的豆血紅蛋白含量、功能葉片中谷氨酰胺合成酶的活性和籽粒蛋白質(zhì)含量均顯著高于NT植株。(3)相關(guān)性分析表明,豆血紅蛋白含量、谷氨酰胺合成酶活性、總磷、總氮含量4個指標(biāo)間均呈顯著正相關(guān)關(guān)系。(4)GmENOD40a、GmENOD40b、GmGS1β1、GmGS1β2基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量顯著高于NT植株。研究表明,OsPT6基因過表達(dá)增強(qiáng)了菜用大豆在低磷條件下的結(jié)瘤及固氮能力,該研究結(jié)果為進(jìn)一步研究其調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:OsPT6基因;菜用大豆;磷積累;結(jié)瘤;固氮

菜用大豆[Glycinemax(L.) Merr.]也稱毛豆,是一種特用大豆,指在鼓粒盛期(R6)至初熟期(R7)即籽粒飽滿,莢色、籽粒呈翠綠時采摘作為蔬菜食用的大豆[1]。其營養(yǎng)價值高,含有人體必需的多種營養(yǎng)成分,如蛋白質(zhì)、游離氨基酸、礦物質(zhì)和多種維生素等,菜用大豆深受中國及東南亞地區(qū)消費者喜愛,并逐漸受到歐美國家消費者的青睞[2-3]。菜用大豆市場需求量逐年增加,發(fā)展迅速,在中國東南沿海一帶,菜用大豆不僅是區(qū)域特色明顯的優(yōu)勢農(nóng)作物,同時也是主要出口創(chuàng)匯蔬菜[4-5]。

磷為菜用大豆生長的必需元素之一,除參與生長發(fā)育過程外,還參與大豆蛋白質(zhì)和油脂含量的合成。此外,大豆根瘤的形成、氮的固定和氨的轉(zhuǎn)化以及隨后氨基酸的合成更離不開磷[6]。由于風(fēng)化的密集性侵蝕和自由離子及氧化鋁強(qiáng)大的磷固定,熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)的土壤中磷含量比較低,尤其在中國南方的酸性土壤里,無機(jī)磷的濃度低于6 μmol/L,游離磷的比例也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于植物根系吸收的比例[7-8]。近年來,許多學(xué)者對植株磷吸收和新陳代謝的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),無機(jī)態(tài)磷通過根細(xì)胞膜進(jìn)入植物體內(nèi)是由同一或不同家族的多個磷轉(zhuǎn)運蛋白來完成的[9-11]。Pht1是植物中已發(fā)現(xiàn)的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因家族之一,在水稻中有13個成員在磷吸收、轉(zhuǎn)運、再分配等方面起著不同作用,OsPT6基因在水稻中既負(fù)責(zé)土壤中磷素的吸收又有轉(zhuǎn)運功能[12-13]。

在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)或國家,人口增長與食物短缺的矛盾突出,同時因水土流失、土地鹽堿化導(dǎo)致的耕地減少、土壤肥力降低以及連作障礙等情況加劇發(fā)生,轉(zhuǎn)基因技術(shù)正逐漸成為解決這些問題的最有效方式之一。根據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(ISAAA)2014年統(tǒng)計表明,轉(zhuǎn)基因大豆種植面積為7.3×107hm2,占全世界大豆種植面積的77%[14]。

目前,轉(zhuǎn)基因大豆研究已成為國內(nèi)外大豆分子生物學(xué)的研究熱點。Hinchee[15]首次報道成功獲得大豆轉(zhuǎn)基因植株,美國孟山都公司將EPSPS基因轉(zhuǎn)入大豆,培育出“農(nóng)達(dá)”轉(zhuǎn)基因大豆并大面積產(chǎn)業(yè)化[16]。抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆(RR大豆)和高油酸大豆(HO大豆)在國際上的種植面積不斷增加,轉(zhuǎn)基因大豆類型不斷增加。谷曉娜等[17]對hrpZpsta轉(zhuǎn)基因大豆疫霉根腐病和灰斑病抗性進(jìn)行了研究;朱琳峰等[18]對Cp4-epsps抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆相關(guān)性狀進(jìn)行研究;尹青女等[19]向大豆受體導(dǎo)入熱激轉(zhuǎn)錄因子8(Heat shock factor 8)基因,以加強(qiáng)目的基因hsf70的表達(dá)和增加轉(zhuǎn)基因大豆的抗逆性。中國研究者主要在大豆抗病蟲害、抗逆性及大豆油分等重要農(nóng)藝性狀方面獲得轉(zhuǎn)基因植株。然而,關(guān)于低磷條件下轉(zhuǎn)OsPT6基因的菜用大豆結(jié)瘤固氮的相關(guān)研究尚屬空白。本研究以實驗室前期獲得的穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)OsPT6基因的3個株系為實驗材料[20],研究了OsPT6基因在菜用大豆中過量表達(dá)對整個植株生理、農(nóng)藝性狀及結(jié)瘤固氮的影響,揭示了轉(zhuǎn)OsPT6菜用大豆提高磷的高效利用,也可以為后續(xù)分子育種和轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1實驗材料

轉(zhuǎn)OsPT6基因菜用大豆材料為本實驗室提供T3代純合體轉(zhuǎn)基因株系[20](以菜用大豆‘NY-1001’為轉(zhuǎn)化受體品種)。3份轉(zhuǎn)基因材料編號分別是15L-1、15L-2和15L-3;其轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)均為單拷貝[20]。非轉(zhuǎn)基因菜用大豆品種‘NY-1001’為對照。

1.2實驗方法

1.2.1石英砂培養(yǎng)采用砂培以磷酸二氫鉀作為磷源,濃度經(jīng)預(yù)備實驗確定為 20 μmol/L。菜用大豆種子用70%乙醇滅菌,用無菌水沖洗7～8次,然后浸種。2 h后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中,置于25 ℃恒溫箱中避光催芽,待主根長到4～5 cm,開始長須根時,用本實驗室保存的日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)菌液侵染后,移栽到砂培周轉(zhuǎn)箱(380 cm×275 cm×140 cm),裝砂高12 cm,每箱5株,營養(yǎng)液培養(yǎng)。營養(yǎng)液組成:K2SO4600 μmol/L;MgSO4·7H2O 200 μmol/L;CaCl2·2H2O 600 μmol/L;H3BO35 μmol/L;ZnSO4·7H2O 0.75 μmol/L;MnSO4·H2O 1 μmol/L;CoSO4·7H2O 0.2 μmol/L;CuSO4·5H2O 0.2 μmol/L;Na2MoO4·H2O 0.03 μmol/L;Fe-Na EDTA 10 μmol/L。移栽后定期澆灌營養(yǎng)液,并且每周用無菌水沖洗石英砂。

1.2.2轉(zhuǎn)基因菜用大豆鑒定菜用大豆生長30 d,用天根公司DNA提取試劑盒提取幼葉DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆?。分別以GUS引物(5′-TGGTGACG-CATGTCGCGCAAGAC-3′和5′-GGTGATGATAATC-GCCTGATGCAG-3′)、OsPT6引物(5′-CCGACGCCT-ATGACCTCTTCT-3′和5′-GACATCTCCTCCAGC-GACTTCC-3′),利用PCR技術(shù)確定GUS和OsPT6基因表達(dá),從而鑒定轉(zhuǎn)基因植株。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系10 μL:PremixTaq酶5 μL(TaKaRa),10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL,10 ng·μL-1DNA 0.5 μL,ddH2O 3.5 μL。PCR反應(yīng)熱循環(huán)程序為:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性1 min,61.4 ℃復(fù)性1 min,72 ℃延伸2 min,30個循環(huán);72 ℃延伸10 min,最后4 ℃保存。特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖、EB染色檢測。

為了確認(rèn)所用試驗材料均是轉(zhuǎn)基因菜用大豆,利用TaKaRa公司RNA提取試劑盒提取植株葉片RNA,用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,以非轉(zhuǎn)基因植株(NT)為對照,以大豆GmSKIP16(5′-GAGC-CCAAGACATTGCGAGAG-3′和5′-CGGAAGCGGA-AGAACTGAACC-3′)為內(nèi)參基因[21],采用qRT-PCR方法檢測OsPT6基因在葉片中的相對表達(dá)量。熒光定量PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s后,95 ℃變性5 s,60 ℃退火20 s,40個循環(huán)。根據(jù)Ct值計算相對表達(dá)量。

1.2.3植株生長發(fā)育指標(biāo)測定大豆鼓粒初期之前,磷素營養(yǎng)水平是產(chǎn)量形成的關(guān)鍵因素[22],因而本研究在砂培生長35 d,游標(biāo)卡尺測莖粗;直尺測株高。取鮮樣,用葉面積測定儀測葉面積。取植株,測地上部、地下部質(zhì)量以及根瘤數(shù);然后105 ℃下殺青30 min,70 ℃烘箱中72 h至恒重,測量干物質(zhì)量。用光合儀測定植株的第二片真葉的光合效率;葉綠素測定儀測定葉綠素含量;葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量用紫外分光光度計測量。在生長過程中測量單株花數(shù)、單株有效莢數(shù)、單株粒數(shù)、單株產(chǎn)量等生長發(fā)育指標(biāo)。

1.2.4植株有效磷、全磷、全氮以及大豆籽粒中蛋白質(zhì)含量的測定35 d苗齡時測定全磷、全氮含量,首先準(zhǔn)確稱取0.10 g烘干的植物樣品,采用H2SO4-H2O2消化法[23]。全氮用凱氏定氮儀測定。全磷測定采用鉬銻抗比色法。考馬斯亮藍(lán)染色法測定大豆籽粒中蛋白質(zhì)含量[24]。

1.2.5豆血紅蛋白含量和谷氨酰胺合成酶活性的測定35 d苗齡時測定豆血紅蛋白含量,參照王樹起等[24]的方法,并作適當(dāng)修改。取一定量的新鮮根瘤,液氮研磨成粉,放入4 ℃、0.1 mol/L磷酸緩沖溶液混合均勻(體積比為1∶4),4 ℃、1 000 r/min離心15 min,取上清液,4 ℃、40 000 r/min離心15 min,所得上清液在540 nm下測量吸光值。谷氨酰胺合成酶活性測定使用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒[25]。

1.2.6熒光定量PCR分析取新鮮根瘤0.10 g,用TaKaTa RNA試劑盒提取RNA,質(zhì)量檢測合格的RNA使用寶生物的M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GmCons6(5′-AGATAGGGAAATGGTGCAGGT-3′和5′-CTAATGGCAATTGCAGCTCTC-3′)為內(nèi)參基因[26],利用qRT-PCR檢測與結(jié)瘤和固氮相關(guān)基因的相對表達(dá)量。4個相關(guān)基因包括2個早期的結(jié)瘤素基因:GmENOD40a(5′-TCTCTCTTGAGTGGCAGAA-GCA-3′和5′-TGGAGTCCATTGCCTTTTCG-3′)和GmENOD40b(5′-GAGTGGCGGAAGCAGA-TACAC-3′和5′-CTACATAGCCATAGAGACCC-CAATG-3′),2個胞質(zhì)谷氨酰胺合成酶基因:GmGS1-β1(5′-GCTTTTCTTAGTAGGATTTGGTCTC-3′和5′-TAACAATCGGAAAACGAGGGA-3′)和Gm-GS1β2(5′-GTGGAAGCCATGAGCAAAACT-3′和5′-CGAGGGAAAGGAATAGAAAACA-3′)[27-28]。熒光定量PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s后,95 ℃變性5 s,60 ℃退火20 s,40個循環(huán)。根據(jù)Ct值計算相對表達(dá)量。

1.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析所得數(shù)據(jù)由統(tǒng)計軟件Excel和SPSS 19.0進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)OsPT6基因菜用大豆植株的確認(rèn)

如圖1,A 所示,GUS基因呈陽性,而且出現(xiàn)預(yù)期的OsPT6基因條帶。如圖1,B所示,3個重復(fù)株系的葉片中OsPT6基因表達(dá)均有較高水平,而對照非轉(zhuǎn)基因植株中沒有表達(dá)。因此,確定這些植株就是轉(zhuǎn)基因植株,可以作為本研究實驗材料。

2.2生長發(fā)育指標(biāo)的比較

低磷處理后,轉(zhuǎn)基因植株生長狀態(tài)良好,與NT植株相比,植株較高,葉面積較大,根系發(fā)達(dá),葉片較多且濃綠,而NT植株葉片出現(xiàn)枯斑,葉邊緣干枯死亡(圖2,A～C)。低磷處理75 d后,轉(zhuǎn)基因植株仍有較多葉片,而NT 植株葉片脫落嚴(yán)重(圖2,D)。低磷處理90 d后,收獲種子,轉(zhuǎn)基因植株單株豆粒數(shù)和單株總豆粒重量顯著高于NT植株,說明轉(zhuǎn)基因植株磷素營養(yǎng)狀態(tài)明顯優(yōu)于NT植株(表1)。

由表1可知,低磷營養(yǎng)液培養(yǎng),轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因菜用大豆的長勢有明顯差異。轉(zhuǎn)基因植株的葉面積、株高、莖粗、根長、地下部重顯著高于NT植株,有利于植株營養(yǎng)生長,并為提高產(chǎn)量打下基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)基因植株單株花數(shù)較NT植株增加24.00%～34.67%,其莢數(shù)、種子數(shù)和種子重量也顯著高于NT。轉(zhuǎn)基因大豆根瘤數(shù)也顯著高于非轉(zhuǎn)基因大豆。表明轉(zhuǎn)基因菜用大豆在低磷條件下通過對更多磷的吸收促進(jìn)根瘤的產(chǎn)生,從而影響大豆相關(guān)氮代謝。

2.3有效磷、總磷及總氮含量的比較

在低磷條件下,轉(zhuǎn)基因植株根、莖、葉以及根瘤中有效磷濃度均顯著高于NT植株(圖3,A);轉(zhuǎn)基因植株總磷干重含量介于0.89～0.96 mg·g-1之間顯著高于NT植株的0.71 mg·g-1,轉(zhuǎn)基因植株全株總氮含量介于1.57～1.69 mg·g-1之間,顯著高于NT植株的0.98 mg·g-1(圖3,B);表明過表達(dá)OsPT6基因增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對磷和氮的吸收和轉(zhuǎn)運能力。

A.T3代轉(zhuǎn)基因植株GUS和OsPT6基因的PCR檢測:M.Marker;P.陽性對照;N.陰性對照;

A.低磷處理45 d;B、C.A中葉片的放大圖像;D.低磷處理75 d。OsPT6 T3.T3代轉(zhuǎn)基因植株;NT.非轉(zhuǎn)基因植株

2.4豆血紅蛋白和谷氨酰胺合成酶活性以及大豆籽粒蛋白質(zhì)含量的比較

豆血紅蛋白在根瘤菌與豆科植物共生后出現(xiàn),常常作為衡量豆科植物共生固氮作用活性的指標(biāo)[29]。由圖4,A可知,豆血紅蛋白主要存在于根瘤中,并且轉(zhuǎn)基因植株的豆血紅蛋白含量(107.3～124.13 μg·g-1)較NT植株(60.5 μg·g-1)增加了77.36%～105.17%,且差異顯著。因此低磷條件下,相比于NT植株而言,轉(zhuǎn)基因植株根瘤的固氮能力得到提升,使大豆的固氮效率顯著升高。

谷氨酰胺合成酶(GS;EC6.3.1.2)是植物氮同化途徑中最為關(guān)鍵的催化酶之一,對植物氮吸收、同化和利用效率有極重要的作用;GS活性越高越有利于蛋白質(zhì)合成[30]。由圖4,B可知,谷氨酰胺合成酶在功能葉片中活性明顯高于根瘤;在功能葉片中,轉(zhuǎn)基因植株谷氨酰胺合成酶的活性(130.96～142.45 U·g-1)較NT植株(70.33 U·g-1)增加了86.21%～102.59%。

在低磷條件下轉(zhuǎn)基因株系15L-1、15L-2和15L-3大豆籽粒蛋白質(zhì)含量分別為(38.71±0.5)%、(40.14±0.2)%和(37.25±0.3)%,而NT 植株的蛋白質(zhì)含量為(31.85±0.4)%,轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株之間存在顯著差異。

2.5相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析表明,菜用大豆以下各生理指標(biāo)均呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系(表2)。其中,GS活性與總磷含量存在顯著正相關(guān)(P<0.05),與總氮含量存在極顯著正相關(guān)(P<0.01);豆血紅蛋白含量與總磷含量存在顯著正相關(guān)(P<0.05);總磷含量與總氮含量間存在顯著正相關(guān)(P<0.05);籽粒蛋白質(zhì)含量與其他各生理指標(biāo)均存在正相關(guān)關(guān)系。以上相關(guān)性分析結(jié)果進(jìn)一步證明了磷在大豆生長發(fā)育中起著不可替代的作用,轉(zhuǎn)基因植株較NT植株具有更強(qiáng)的磷吸收、富集以及轉(zhuǎn)化能力。

表1　低磷條件下轉(zhuǎn)基因植株與NT的生長指標(biāo)差異

注:表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n=8).同行不同小寫字母表示同一磷處理條件下株系間Duncan’s多重比較在0.05水平差異顯著。

Note:The data represent the means±SD (n=8).Different normal letters within same row indicate a significant difference between the plant lines according to Duncan’s new multiple range test under the same phosphorus condition (P<0.05).

同一組不同小寫字母表示Duncan’s多重比較在0.05水平上差異顯著;下同

圖4　轉(zhuǎn)基因植株與NT植物根瘤和葉片中豆血紅蛋白含量(A)和谷氨酰胺合成酶活性(B)

指標(biāo)IndicesGS活性GSactivity豆血紅蛋白含量Leghemoglobincontent總磷含量TotalPcontent總氮含量TotalNcontentGS活性GSactivity1 0.9470.971*0.998**豆血紅蛋白含量Leghemoglobincontent0.94710.953*0.935總磷含量TotalPcontent0.971*0.953*10.955*總氮含量TotalNcontent0.998**0.9350.955*1

注:*表示在0.05水平顯著相關(guān);**表示在0.01水平顯著相關(guān)。

Note:* indicates significant correlation at 0.05 level;** indicate significant correlation at 0.01 level.

2.6轉(zhuǎn)基因和NT植株結(jié)瘤及固氮相關(guān)基因表達(dá)量的比較

為了探究OsPT6基因過表達(dá)對結(jié)瘤及固氮相關(guān)基因表達(dá)的影響,利用qRT-PCR檢測GmENOD40a、GmENOD40b、GmGS1β1、GmGS1β2基因的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示,與NT植株相比,這4個基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量均顯著升高(圖5)。

3討論

磷對菜用大豆生長具有重要作用,磷素缺乏會影響植株生長;具體表現(xiàn)為對地上部生長的抑制,如植株矮小,葉片小及葉片出現(xiàn)枯斑等[31-32]。磷利用效率的提高有利于增加低磷條件下植株的產(chǎn)量,如PHF1介導(dǎo)磷轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,在水稻中OsPHF1基因過表達(dá),提高了植株對磷的吸收能力,在大田試驗中單株產(chǎn)量顯著增加[11]。本研究中,低磷處理30 d后,轉(zhuǎn)基因植株生長良好,生長狀態(tài)如株高、莖粗等方面較NT植株優(yōu)勢顯著;隨著培養(yǎng)時間延長,NT植株出現(xiàn)葉片失綠、花少、莢少、籽粒少等缺磷癥狀,這是由于轉(zhuǎn)基因體內(nèi)磷素營養(yǎng)高于NT植株的結(jié)果。

圖5　轉(zhuǎn)基因植株和NT植株根瘤中的結(jié)瘤及

在植物體內(nèi),磷轉(zhuǎn)運蛋白在磷素的吸收和轉(zhuǎn)運過程起著重要的作用[33-34]。在低磷條件下轉(zhuǎn)煙草(NicotianatabacumL.)NtPt1基因的水稻,葉片中磷積累量較非轉(zhuǎn)基因植株提高了41% 。水稻中OsPT8基因的過表達(dá)使得葉片和根中磷積累顯著增加[35]。本研究中,低磷條件下轉(zhuǎn)OsPT6基因的菜用大豆植株中有效磷、總磷的含量均顯著高于NT植株,表明OsPT6基因過表達(dá)在轉(zhuǎn)基因植株中發(fā)揮作用,提高了大豆植株對低磷環(huán)境的耐受能力、磷素的攝取能力,提高植株體內(nèi)磷素的積累和磷的利用效率,這與Seo等[36]在水稻上的研究結(jié)果一致。此外,轉(zhuǎn)基因菜用大豆植株莖和葉片的有效磷含量均較NT植株顯著增加,表明在轉(zhuǎn)基因植株中OsPT6基因過表達(dá)有利于磷從根部向地上部轉(zhuǎn)運。轉(zhuǎn)基因植株中的根瘤數(shù)、總氮含量顯著高于NT植株,表明OsPT6基因過表達(dá)提高菜用大豆的結(jié)瘤及固氮能力。

豆血紅蛋白作為氧的載體,本身不能固氮,但它能增加類菌體對氧的吸收率,同時提高固氮酶的活性[37]。低磷條件下,轉(zhuǎn)基因菜用大豆植株根瘤的豆血紅蛋白含量顯著高于NT植株,固氮酶的活性得到提升,使大豆的固氮效率顯著升高。植物中所有的氮均必須經(jīng)過谷氨酰胺合成酶(GS)催化反應(yīng)途徑才能進(jìn)一步形成氨基酸并最終轉(zhuǎn)變積累為蛋白質(zhì),對于菜用大豆生長和籽粒蛋白質(zhì)合成影響很大[38]。本研究中轉(zhuǎn)基因植株GS活性顯著高于NT植株,有利于菜用大豆的生長以及籽粒蛋白質(zhì)合成,提高菜用大豆品質(zhì)。相關(guān)性分析表明,低磷條件下轉(zhuǎn)基因與NT植株的總磷、總氮、豆血紅蛋白和谷氨酰胺合成酶4個指標(biāo)間均呈正相關(guān),也進(jìn)一步證明了磷氮之間存在互作效應(yīng),磷的高效利用能促進(jìn)氮的吸收;豆血紅蛋白含量和GS的活性提高,從而提高結(jié)瘤及固氮能力。

GmENOD40a和GmENOD40b作為大豆根瘤早期結(jié)瘤素基因,在根瘤發(fā)育和氮運輸過程中起著重要作用[27]。本研究中,GmENOD40a和GmENOD40b在轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)量顯著高于NT植物。研究表明GmGS1β1、GmGS1β2作為豆科特有的基因,其表達(dá)受外界環(huán)境的影響,是環(huán)境因子調(diào)節(jié)植物氮素同化的重要分子靶點[39]。低磷條件下,GmGS1β1、GmGS1β2在轉(zhuǎn)基因菜用大豆植株中的表達(dá)水平顯著高于NT植株。這表明這4個基因的高表達(dá)有助于轉(zhuǎn)基因植株結(jié)瘤及固氮。

綜上所述,在低磷條件下,OsPT6基因過表達(dá)增強(qiáng)了菜用大豆植株結(jié)瘤固氮相關(guān)基因(GmENOD40a、GmENOD40b、GmGS1β1、GmGS1β2)的表達(dá)水平,提高了磷素、氮素的積累和豆血紅蛋白含量及谷氨酰胺合成酶活性,從而增強(qiáng)菜用大豆的結(jié)瘤固氮能力,有利于植株的生長發(fā)育。

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(編輯:宋亞珍)

Effects ofOsPT6 Gene Overexpression on Nodulation and Nitrogen Fixation of Vegetable Soybean under Low Phosphorus Conditions

LIU Wei,YANG Lifei,ZHU Wenli,LIU Dandan,ZHU Yuelin*

(College of Horticulture,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

Abstract:By using sand culture,we made comparisons between the T3transgenic lines overexpressed a rice (Oryza sativa L.) phosphate transporter gene OsPT6 and their non-transgenic (NT) host cultivar to examine the differences in the traits of growth and development,the concentrations of available phosphorus,total phosphorus,total nitrogen,and leghemoglobin,the activities of glutamine synthetase and the contents of seed proteins in vegetable soybean under low phosphorus conditions.In addition,the relative expression levels of some genes related to the nodulation and nitrogen fixation in roots were also measured.The purpose of this research was to provide the theoretical basis for elucidating the mechanisms of nodulation and nitrogen fixation in the roots of the transgenic plants under phosphorus deficiency.The results showed that:(1)the plant height,stem diameter,numbers of flowers,pods and root nodules of the transgenic plants were significantly higher than those of the NT plants.(2)The concentrations of available phosphorus in roots,stems,leaves and nodules,the contents of phosphorus and nitrogen of the whole plant,the concentrations of leghemoglobin in the nodules and the activities of glutamine synthetase in functional leaves of the transgenic plants were significantly higher than those of the NT plants.(3)The mutually significant positive correlations were observed among the concentrations of leghemoglobin,total phosphorus,total nitrogen,and the activity of glutamine synthetase.(4)The relative expression levels of GmENOD40a,GmENOD40b,GmGS1β1,GmGS1β2 genes in transgenic plants were significantly higher than those in the NT plants.The above results indicated that the overexpression of OsPT6 gene enhances the ability of nodulation and nitrogen fixation in the transgenic vegetable soybean under low phosphorus conditions,which lays the foundations for the further studies on their regulation mechanisms.

Key words:OsPT6 gene;vegetable soybean;phosphorus accumulation;nodulation;nitrogen fixation

中圖分類號:Q786;Q789

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡介:劉偉(1989-),男,在讀碩士研究生,主要從事蔬菜栽培生理與生物技術(shù)研究。E-mail:cawayliu@163.com*通信作者:朱月林,教授,主要從事蔬菜栽培生理與生物技術(shù)研究。E-mail:ylzhu@njau.edu.cn

基金項目:國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(2014ZX08004-005-007);作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室開放基金(ZW2013006),江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目(2014PAPD)

收稿日期:2015-11-25;修改稿收到日期:2016-01-06

文章編號:1000-4025(2016)02-0266-08

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.02.0266