烏梅丸方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡的影響*

閆曙光，惠 毅，李京濤

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽(yáng) 712046;2.陜西省胃腸病證方藥重點(diǎn)研究室，陜西咸陽(yáng) 712046)

烏梅丸方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡的影響*

閆曙光1，2，惠 毅1，李京濤1

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽(yáng) 712046;2.陜西省胃腸病證方藥重點(diǎn)研究室，陜西咸陽(yáng) 712046)

目的:探討烏梅丸方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡的影響。方法:SD大鼠用TNBS/乙醇灌腸誘導(dǎo)形成潰瘍性結(jié)腸炎，灌胃烏梅丸水煎劑，Q-PCR法檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸上皮組織Fas、FasL表達(dá)，ELISA法檢測(cè)結(jié)腸上皮組織Caspase-3的表達(dá)，HE染色觀察大鼠結(jié)腸病理組織學(xué)變化。結(jié)果:與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞Fas、FasLmRNA表達(dá)、Caspase-3含量顯著升高;與模型組比較，烏梅丸大、中、小劑量組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞Fas、FasLmRNA表達(dá)、Caspase-3含量顯著降低;與烏梅丸大劑量組比較，烏梅丸中、小劑量組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞Fas、FasLmRNA表達(dá)、Caspase-3含量顯著升高。結(jié)論:烏梅丸可通過(guò)抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞的過(guò)度凋亡對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎起治療作用，以大劑量組療效最佳。

潰瘍性結(jié)腸炎;烏梅丸;細(xì)胞凋亡

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是以腹痛、黏液膿血便為主要臨床表現(xiàn)的難治性疾病，病情可反復(fù)發(fā)作、遷延不愈，是結(jié)腸腫瘤的主要誘因之一［1］。病理組織學(xué)研究表明，腸黏膜屏障的持續(xù)損傷是潰瘍性結(jié)腸炎的核心病變［2］。腸黏膜屏障具有腸道保持完整性和抵御外源性微生物侵襲的重要作用，分為物理屏障和化學(xué)屏障。結(jié)腸上皮細(xì)胞既是物理屏障的組成部分，其所分泌黏蛋白、防衛(wèi)素等多肽抗菌素又構(gòu)成了化學(xué)屏障，由此可見(jiàn)，上皮細(xì)胞是結(jié)腸黏膜發(fā)揮屏障作用的關(guān)鍵。進(jìn)一步的研究表明，結(jié)腸黏膜屏障損傷的主要原因是由于結(jié)腸上皮細(xì)胞的過(guò)度凋亡引起的數(shù)量減少，其物理屏障和化學(xué)屏障功能失常，最終導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生［3］。因此，抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞的過(guò)度凋亡為潰瘍性結(jié)腸炎的治療提供了新的思路。烏梅丸是《傷寒論》中治療“久瀉、久利”的經(jīng)方，為歷代醫(yī)家所推崇，治療潰瘍性結(jié)腸炎療效確切［4］。藥理研究表明，該方可通過(guò)抗炎、止瀉、止痛等途徑對(duì)UC發(fā)揮治療作用［5］?；诩?xì)胞凋亡在潰瘍性結(jié)腸炎治療中的作用以及烏梅丸的良好療效，課題組開(kāi)展了烏梅丸方對(duì)UC大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡影響的研究，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量(220 g±20)g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK(陜)2012-003)，動(dòng)物飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 藥物 烏梅丸方［5］組成:烏梅16 g，人參6 g，當(dāng)歸4 g，干姜10 g，細(xì)辛6 g，桂枝6 g，附子6 g，蜀椒4 g，黃連16 g，黃柏6 g，以上藥物除附子、細(xì)辛外均加水浸泡，附子、細(xì)辛先煎30 min，余常規(guī)煎煮、濃縮后4℃冰箱保存?zhèn)溆?。中藥飲片?gòu)于陜西興盛德中藥有限公司，經(jīng)我校中藥教研室鑒定合格。

1.1.3 主要試劑 2，4，6-三硝基苯磺酸TNBS (批號(hào)0002508192)，美國(guó)SIGMA公司;RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、Q-PCR SuperMix(批號(hào)分別為I20123，H51028，H41129)，北京全式金生物技術(shù)有限公司;引物設(shè)計(jì)與合成(批號(hào)見(jiàn)表1)，南京金斯瑞生物科技有限公司;Caspase-3 ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)201407)，武漢伊萊瑞特生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 主要儀器 NANODROP2000C型核酸測(cè)定儀，Thermo(美國(guó))公司;ELX808型酶標(biāo)儀，美國(guó)博騰公司;EDC-810型PCR儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模 大鼠稱重后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、烏梅丸大、中、小劑量組5組各組10只。除空白組外，余禁食24 h后水合氯醛麻醉，用直徑2.0 mm的硅膠管由肛門(mén)輕緩插入約6～8 cm處，將50%的TNBS/乙醇溶液按100 mg ·kg－1劑量緩慢注入結(jié)腸，大鼠倒置30 s，誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎形成［6］。造模8 h后開(kāi)始灌胃給藥，給藥劑量參照前期研究結(jié)果［7］:烏梅丸小劑量組13.3 g· kg－1，中劑量組 26.6 g·kg－1，大劑量組 53.2 g· kg－1，空白組、模型組均給予生理鹽水10 ml·kg－1，以上各組每日灌胃1次，連續(xù)10 d。

1.2.2 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 取距大鼠肛門(mén)6～8 cm間約0.5 cm結(jié)腸組織，10%甲醛固定，梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片，HE染色觀察結(jié)腸病理組織學(xué)變化。

1.2.3 結(jié)腸上皮細(xì)胞Caspase-3的檢測(cè) 取距大鼠肛門(mén)6～8 cm間0.5 cm結(jié)腸段，刮取黏膜制成組織勻漿，ELISA法檢測(cè)結(jié)腸黏膜Caspase-3的含量，具體實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 結(jié)腸上皮細(xì)胞織Fas、FasL表達(dá)的檢測(cè) 表1顯示，取距大鼠肛門(mén)6～8 cm間約1 cm結(jié)腸段，生理鹽水清洗刮取黏膜層，置于EP管中，加入約1 ml組織裂解液制成組織勻漿，按RNA提取試劑盒所列步驟提取總RNA。取2 μL總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA，合成后測(cè)定cDNA濃度備用。Q-PCR法檢測(cè)mRNA表達(dá)，PCR采用20 μL反應(yīng)體系［10］:PCR Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA體積依據(jù)濃度添加，加滅菌蒸餾水補(bǔ)足至20 μL;反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s; 57℃退火45 s;72℃延伸40 s;共40～45個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸10 min。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，2組比較采用LSD和SNK法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 PCR引物序列及批號(hào)

2 結(jié)果

2.1 烏梅丸方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化的影響。

圖1顯示，空白組大鼠結(jié)腸上皮組織結(jié)構(gòu)完整，界限清晰，結(jié)腸黏膜表面光滑，腺體排列整齊有序，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、出血等病理改變。模型組大鼠結(jié)腸黏膜大面積缺損，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體排列紊亂甚至萎縮或消失，杯狀細(xì)胞數(shù)目明顯減少，甚至可見(jiàn)黏膜下層炎癥和出血，為典型的潰瘍性結(jié)腸炎病理組織學(xué)表現(xiàn)。經(jīng)給藥治療后，烏梅丸大、中劑量組大鼠結(jié)腸黏膜仍可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但腺體排烈紊亂明顯減少，黏膜缺損面減小，黏膜下層炎癥和出血明顯減少;烏梅丸小劑量組大鼠仍可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，甚至達(dá)黏膜下層，大片黏膜缺損或壞死，表面不平，腺體結(jié)構(gòu)不完整，杯狀細(xì)胞數(shù)目減少。

圖1 各組大鼠結(jié)腸病理組織學(xué)觀察(HE染色，×50)

2.2 烏梅丸方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞Fas、FasLmRNA和Caspase-3表達(dá)的影響。

表2顯示，與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞Fas、FasLmRNA和Caspase-3表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.01)，表明造模后，結(jié)腸上皮細(xì)胞Fas和FasL蛋白結(jié)合增強(qiáng)，激活下游Caspase-3蛋白，誘發(fā)結(jié)腸上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡，引起黏膜屏障功能降低，加重黏膜損傷;給藥治療后與模型組比較，烏梅丸大、中、小劑量組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞Fas、FasLmRNA表達(dá)顯著減弱，Caspase-3表達(dá)顯著降低(P＜0.01)，表明烏梅丸能有效抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞的過(guò)度凋亡，促進(jìn)黏膜屏障功能和受損黏膜的恢復(fù)，對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)揮了治療作用;各給藥組間比較，大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞Fas、FasLmRNA和Caspase-3的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，其中大劑量組最低，中劑量組次之，小劑量組最高，表明烏梅丸抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡的作用與劑量成正比關(guān)系。

3 討論

細(xì)胞凋亡是指在一定的生理或病理?xiàng)l件下，細(xì)胞接受刺激信號(hào)后的一種自主的、由凋亡相關(guān)基因控制的細(xì)胞程序性死亡方式，生理狀態(tài)下的細(xì)胞凋亡有助于維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，病理狀態(tài)下的凋亡則會(huì)引起自體損傷［7］。當(dāng)潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生時(shí)，結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡增多，在UC炎癥活動(dòng)區(qū)域，正在分化的結(jié)腸上皮細(xì)胞通過(guò)凋亡大量提前死亡導(dǎo)致UC結(jié)腸上皮的物理屏障和化學(xué)屏障功能破壞，導(dǎo)致結(jié)腸黏膜的損傷并最終形成潰瘍面，因此抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞的過(guò)度凋亡、修復(fù)受損的黏膜組織成為目前潰瘍性結(jié)腸炎治療的研究熱點(diǎn)之一［3］。多項(xiàng)研究表明，Caspase-3、Fas和FasL是控制結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡的主要基因［8］。Caspase-3屬于Caspase超家族成員，是控制細(xì)胞凋亡的基因之一，一旦Caspase-3被激活細(xì)胞凋亡將會(huì)不可逆地進(jìn)行下去，因此Caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志［9］。Fas是屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員的一種跨膜蛋白，它與其配體FasL結(jié)合后會(huì)啟動(dòng)凋亡信號(hào)并最終引起細(xì)胞凋亡。嚴(yán)瑾［10］等研究證實(shí)，在潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸上皮細(xì)胞的凋亡過(guò)程中，F(xiàn)as/FasL配體所介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)揮了關(guān)鍵作用，通過(guò)檢測(cè)Fas/FasL的表達(dá)也許可作為預(yù)示UC疾病活動(dòng)性的重要指標(biāo)。綜上所述，針對(duì) Caspase-3、Fas/ FasL這條信號(hào)通路予以阻斷，為UC的治療提供了新的機(jī)制［11］。

表2 各組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞Fas、FasLmRNA、Caspase-3表達(dá)比較(±s)

表2 各組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞Fas、FasLmRNA、Caspase-3表達(dá)比較(±s)

注:與空白組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與烏梅丸大劑量組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 鼠數(shù) 劑量g·kg－1 Fas(mRNA) FasL(mRNA) Caspase-3(ng·ml－1)空 白 組 10 —1.05±0.04 1.06±0.04 1.78±0.05模 型 組 10 — 1.91±0.07＊＊ 1.87±0.08＊＊ 2.24±0.07＊＊烏梅丸大劑量組 10 53.2 1.38±0.04## 1.45±0.02## 1.89±0.05##烏梅丸中劑量組 10 26.6 1.44±0.03##▲ 1.54±0.04##▲ 1.99±0.08##▲烏梅丸小劑量組 10 13.3 1.64±0.04##▲▲ 1.63±0.03##▲▲ 2.12±0.06#▲▲

烏梅丸在《傷寒論》中不僅治療蛔厥，還能治療“久瀉、久利”，后世醫(yī)家據(jù)此將烏梅丸列入治療痢疾、泄瀉等疾病的方劑中，用于治療下利類疾病。如《千金方》中載其能治“久痢，諸藥不瘥數(shù)十年者，消谷下氣，補(bǔ)虛，暴痢，冷痢久下”，《外臺(tái)秘要》中用其治療“冷痢久下”，《普濟(jì)方》中用治“諸痢久下”，《醫(yī)宗金鑒》記載該方治“久痢臟有寒熱不分”。潰瘍性結(jié)腸炎是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病名，屬于中醫(yī)學(xué)“下利，痢疾”范疇，因潰瘍性結(jié)腸炎疾病的發(fā)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，臨床表現(xiàn)中有虛實(shí)寒熱等不同，但其發(fā)病過(guò)程可見(jiàn)由實(shí)而虛、由表及里、由輕到重的過(guò)程，其病機(jī)多為虛實(shí)寒熱錯(cuò)雜。烏梅丸具有清熱燥濕、溫中散寒、補(bǔ)益氣血、收斂固澀的功效，正對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎虛實(shí)寒熱錯(cuò)雜的病機(jī)，故臨床療效顯著，但目前缺少該方的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，其具體作用機(jī)制尚不十分明確。本次實(shí)驗(yàn)研究表明，烏梅丸方能降低結(jié)腸上皮Caspase-3蛋白的表達(dá)，降低結(jié)腸上皮細(xì)胞Fas和FasL mRNA的過(guò)度表達(dá)，從而抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞的過(guò)度凋亡，促進(jìn)結(jié)腸黏膜屏障的修復(fù)，對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)揮治療作用，這可能是該方的作用機(jī)制之一。各治療組間比較結(jié)果表明，烏梅丸抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡的作用與劑量成正比。烏梅丸是傳統(tǒng)經(jīng)方，其藥物組成復(fù)雜，體現(xiàn)了多種治法的綜合。本次研究只是從細(xì)胞凋亡的角度對(duì)該方的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探索，其具體的作用機(jī)制還需更加深入的研究。

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Effect of Wumei Pill on Apoptosis of Colonic Epithelial Cells in Rats with Ulcerative Colitis

YAN Shu-guang1，2，HUI Yi1，Li Jing-tao1
(1.Shaanxi university of TCM，Shaanxi Xianyang 712046，China;2.Shaanxi gastrointestinal disease and syndrome formulae key laboratory，Shaanxi Xianyang 712046，China)

Objective:To observe the effect of Wumei Pill in colonic epithelial cell apoptosis of ulcerative colitis rats.Methods:Selecting male SD rats and establishing ulcerative colitis model.All the rats except blank group were given Wumei Pill or its Subdivisions，then test the Fas、FasL expressions by Q-PCR method and Caspase-3 expressions in Q-PCR method of rats’colonic tissue.Results:Compared with blank group，F(xiàn)as，F(xiàn)asL，Caspase-3 expression were statistically significant in model group rats.Compared with model group，there were statistically significant in Wumei Pill high，middle and low groups.Compared with Wumei Pill high groups，there was statistically significant in Wumei Pill middle and low groups.Conclusion:Wumei Pill has therapeutic effect on ulcerative colitis through inhibiting the excessive apoptosis of colon epithelial cells，and the therapeutic effect of Wumei Pill high groups is better than that of middle and low groups.

Ulcerative colitis;Wumei Pill;Cell apoptosis

R285.5

B

1006-3250(2016)06-0771-03

2015-12-16

陜西省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(13-jc020)-基于細(xì)胞凋亡研究烏梅丸及拆方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制;陜西省科技廳項(xiàng)目(2013JQ4006)-烏梅丸拆方對(duì)UC大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞和PMN凋亡的影響

閆曙光(1981-)，男，陜西戶縣人，講師，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)藥消化系統(tǒng)疾病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究。